Cloning, expression, purification and characterization of Lytic Plysaccharide Monooxygenases from Streptomyces coelicolor and Donesia denitrificans
Master thesis
Permanent lenke
http://hdl.handle.net/11250/186555Utgivelsesdato
2014-02-19Metadata
Vis full innførselSamlinger
- Master's theses (KBM) [927]
Sammendrag
Enzymatisk nedbrytning av polysakkaridene cellulose og kitin er en essensielt trinn i prosessen hvor biomasse konverteres til verdifulle produkter. Utvikling og forbedring av enzymteknologi for omdanning av biomasse er derfor viktig for å forbedre prosessene, samt for å få en bedre forståelse for hvordan enzymene virker. Det er velkjent at effektiv nedbrytning av cellulose og kitin krever samspill mellom komplementerende hydrolytiske enzymer (glykosid hydrolaser; cellulaser og kitinaser). Nylig har også en ny klasse enzymer viktig for biomassenedbrytning blitt oppdaget nemlig lytisk polysakkarid monooxyginaser (LPMOer). Disse enzymer spalter krystallinsk cellulose eller kitin ved hjelp av en oksidativ mekanisme. I kombinasjon med vanlige glykosid hydrolaser øker LPMOene nedbrytningshastigheten av biomasse, hvilket gjør disse enzymene meget interessante for biomas relatert enzymteknologi. Siden oppdagelsen av LPMOer ble gjort for kun 3 år siden har bare noen få enzymer blitt karakterisert. Samtidig er den katalytiske mekanismen fortsatt ukjent. Det er derfor et stort behov for ytterligere karakterisering av ulike LPMOs.
Denne studien fokuserer på karakterisering av to LPMO-moduler fra ulike Gram-positive bakterier. Det første enzymet er Cels2, en cellulose aktiv LPMO fra Streptomyces coelicolor bestående av en LPMO katalytisk module og en CBM2 cellulose-bindene modul. Det andre enzymet er Jden1381 som er en ukarakterisert kitin-aktivt multidomene enzyme fra Jonesia denitrificans bestående av en LPMO katalytisk module, en CBM5/12 kitin-bindenen modul og en GH18 katalytisk modul (kitinase).
Funksjonen til tre konserverte aminosyrer forbundet med det aktive setet til CelS2 (Arg212, Ser215, og Phe219) ble karakterisert ved mutagenes og analyse av aktivitet av Aktivitet mot PASC (phosphoric-acid swollen cellulose) ble målt med både massespektrometri og HPLC og det viste seg at mutasjonene R212A og F219Y inaktiveres enzymet, mens mutasjonene S215A og F219A redusert aktivitet med henholdsvis 50 og 85% sammenliknet med villtype enzymet.
Det andre enzymet analysert i dette studiet, Jden1381, representerer et hittil ukarakterisert kombinasjon av kitin-aktive katalytiske moduler, nemlig en LPMO kombinert med en kitinase (GH18) . Siden det er kjent at LPMOer og kitinaser viser sterk synergi sammen, bør det kitinolytiske potensiale til et slikt multidomeneprotein være stort.