Determination of antibiotic resistance in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa

Abstract

Bakterien Pseudomonas aeruginosa er en gram-negativ opportunistisk patogen bakterie som kan infisere mennesker med nedsatt immunforsvar, slik som pasienter født med den recessivt arvelige sykdommen cystisk fibrose (CF). Bakterien er allment til stede og kjennetegnes av til høye tilpasningsevne. P. aeruginosa er på overvåkningslisten til Verdens helseorganisasjon, fordi antimikrobiell resistens (AMR) og til og med multiresistens (MDR) oppstår innenfor bakteriearten [1]. I lungene til pasienter med CF kan bakterien tilpasse seg og vedvare på grunn av den karakteristiske opphopningen av slim som ligger utenpå epitelcellene i lungen. Eksponering av antibiotika i forsøk på å fjerne patogenet, kan føre til utvikling av AMR. Forståelse av hvordan bakterien oppnår resistens mot antibiotika er avgjørende for utviklingen av nye antibiotika. I løpet av dette masterprosjektet har egenskapene rundt antibiotikaresistens til syv kliniske isolater av P. aeruginosa blitt karakterisert. MIC ble bestemt hos alle isolatene mot de tre β-laktamene, Piperacillin/Tazobactam (TZP), Meropenem (MEM) og Ceftazidime (CAZ), et flurokinolon Ciprofloxacin (CIP), et amino- glykosid Tobramycin (TOB) og polymyxin Colistin (CST). PAU5 viste seg å være mul- tiresistent (MDR). Interessant nok ble det observert store endringer i MIC-verdien mellom testing i Mueller-Hinton Broth medium og RPMI-LB10% medium. Noen isolater viste økt MIC-verdi i et næringsfattig medium, mens andre isolater viste en reduksjon. Genomanalysen viste at alle isolater hadde β-laktamaser, samt ulike virulensfaktorer og re- sistensgener som tidligere har blitt identifisert i arten. PAU1 og PAU2 hadde imidlertid ikke efflux-pumpen MexXY-OprM (viktig for utpumping av aminoglykosider). Mangelen på denne efflux-pumpen kunne ikke knyttes til resultatet av MIC-bestemmelsen for de to isolatene. Det ble observert en forskjell i gener involvert i tokomponent reguleringssystem mellom isolatene, og PAU6 hadde flest gener involvert i TCS, noe som kan forklare den lave forskjellen sett i MIC-verdi for dette isolatet ved endring av testmedium. Til slutt ble proteo- manalysen utført på isolatene PAU3 og PAU5, som viste resistens mot henholdsvis to og fire antimikrobielle midler i MIC-analysen. Begge isolatene var i stand til å vokse ved den høyeste konsentrasjonen TZP som ble testet (512/4 μg/mL). β-laktamasen ampC var det mest op- pregulerte proteinet i begge isolatene, men i tillegg ble type VI-sekresjonssystemet observert i PAU5 når isolatet ble eksponert for to forskjellige konsentrasjoner av TZP. Dette ble ikke sett i PAU3. I PAU3 eksponert for den høyeste antibiotikkonsentrasjonen av TZP, ble ampC sam- men med beskyttelsesproteiner mot ROS/NO-skade, sterkt oppregulert sammenlignet med kontroll og den laveste antibiotikkonsentrasjonen. I den høyeste antibiotikakonsentrasjonen viste PAU3 også oppregulering av cspD, et protein involvert i dannelse av "persister"-celler. Konklusjonen var at oppregulering av klasse C β-laktamasen ampC var hovedårsaken til antibiotikaresistensen mot TZP.

The bacterium Pseudomonas aeruginosa is a gram-negative opportunistic pathogen that can infect immunocompromised patients such as patients born with the recessive hereditary genetic disease cystic fibrosis (CF). It is ubiquitously present, and is recognized by its high adaptability. P. aeruginosa is on the watch list of World Health Organization, due to antimicrobial resistance (AMR), and even multidrug resistance (MDR) emerging within the bacterial species [1]. In the cystic fibrosis lung, the pathogen is able to adapt and persist by the characteristic thick mucus lining the epithelial cells in the CF lung. Continued antibiotic exposure in an attempt to remove the pathogen, can result in the development of AMR. Understanding how the bacterium is able to achieve resistance against antibiotics is essential for development of novel antibiotics. During this master project, the antibiotic resistance properties in seven clinical isolates of P. aeruginosa have been characterized. MIC was determined against three β-lactams, Piperacillin/Tazobactam (TZP), Meropenem (MEM), and Ceftazidime (CAZ), the fluroquinolone Ciprofloxacin (CIP), the aminoglycoside Tobramycin (TOB), and the polymyxin Colistin (CST). PAU5 showed to be multi-drug resistant (MDR). Interestingly, large changes in MIC value was seen between testing in Mueller-Hinton Broth and RPMI-LB10. Some isolates showed increased MIC value when in a nutrient-poor medium, while others isolates showed a reduction. Genomic analysis showed all isolates had β-lactamases, as well as the various virulence factors and resistance genes previously identified in the species. PAU1 and PAU2 did, however, not have the efflux pump MexXY-OprM (important in efflux of aminoglycosides). The lack of this efflux pump could not be linked back to the result of the MIC determination for the two isolates. Discrepancy in genes involved in two-component regulatory system (TCS) was seen between isolates, and PAU6 had the most genes involved in TCS which might explain the low difference seen in MIC value for this isolate when changing the medium used for testing. Finally, proteomics analysis was performed on clinical isolates PAU3 and PAU5, which had showed resistance towards two and four antimicrobial agents, respectively, during MIC analy- sis. Both isolates were able to grow at the highest TZP concentration tested (512/4 μg/mL). The β-lactamase ampC was the most up-regulated protein in both isolates, but additionally in PAU5, type VI secretion system was coexpressed with ampC when exposed to two different concentrations of TZP. This was not seen in PAU3. In PAU3 exposed to the highest antibi- otic concentration of TZP, ampC along with protection proteins against ROS/NO damage, was seen highly up-regulated compared to control and the lowest antibiotic concentration. In the highest antibiotic concentration, PAU3 also showed up-regulation of cspD, a protein involved in persister cell formation. The conclusion was that up-regulation of the class C β-lactamase ampC was the main reason for the antibiotic resistance against TZP.