Determination of antibiotic resistance in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa
Master thesis
Permanent lenke
https://hdl.handle.net/11250/3125878Utgivelsesdato
2023Metadata
Vis full innførselSamlinger
- Master's theses (KBM) [890]
Sammendrag
Bakterien Pseudomonas aeruginosa er en gram-negativ opportunistisk patogen bakterie somkan infisere mennesker med nedsatt immunforsvar, slik som pasienter født med den recessivtarvelige sykdommen cystisk fibrose (CF). Bakterien er allment til stede og kjennetegnes av tilhøye tilpasningsevne. P. aeruginosa er på overvåkningslisten til Verdens helseorganisasjon,fordi antimikrobiell resistens (AMR) og til og med multiresistens (MDR) oppstår innenforbakteriearten [1]. I lungene til pasienter med CF kan bakterien tilpasse seg og vedvarepå grunn av den karakteristiske opphopningen av slim som ligger utenpå epitelcellene ilungen. Eksponering av antibiotika i forsøk på å fjerne patogenet, kan føre til utvikling avAMR. Forståelse av hvordan bakterien oppnår resistens mot antibiotika er avgjørende forutviklingen av nye antibiotika. I løpet av dette masterprosjektet har egenskapene rundtantibiotikaresistens til syv kliniske isolater av P. aeruginosa blitt karakterisert.MIC ble bestemt hos alle isolatene mot de tre β-laktamene, Piperacillin/Tazobactam (TZP),Meropenem (MEM) og Ceftazidime (CAZ), et flurokinolon Ciprofloxacin (CIP), et amino-glykosid Tobramycin (TOB) og polymyxin Colistin (CST). PAU5 viste seg å være mul-tiresistent (MDR). Interessant nok ble det observert store endringer i MIC-verdien mellomtesting i Mueller-Hinton Broth medium og RPMI-LB10% medium. Noen isolater viste øktMIC-verdi i et næringsfattig medium, mens andre isolater viste en reduksjon.Genomanalysen viste at alle isolater hadde β-laktamaser, samt ulike virulensfaktorer og re-sistensgener som tidligere har blitt identifisert i arten. PAU1 og PAU2 hadde imidlertidikke efflux-pumpen MexXY-OprM (viktig for utpumping av aminoglykosider). Mangelenpå denne efflux-pumpen kunne ikke knyttes til resultatet av MIC-bestemmelsen for de toisolatene. Det ble observert en forskjell i gener involvert i tokomponent reguleringssystemmellom isolatene, og PAU6 hadde flest gener involvert i TCS, noe som kan forklare den laveforskjellen sett i MIC-verdi for dette isolatet ved endring av testmedium. Til slutt ble proteo-manalysen utført på isolatene PAU3 og PAU5, som viste resistens mot henholdsvis to og fireantimikrobielle midler i MIC-analysen. Begge isolatene var i stand til å vokse ved den høyestekonsentrasjonen TZP som ble testet (512/4 μg/mL). β-laktamasen ampC var det mest op-pregulerte proteinet i begge isolatene, men i tillegg ble type VI-sekresjonssystemet observert iPAU5 når isolatet ble eksponert for to forskjellige konsentrasjoner av TZP. Dette ble ikke setti PAU3. I PAU3 eksponert for den høyeste antibiotikkonsentrasjonen av TZP, ble ampC sam-men med beskyttelsesproteiner mot ROS/NO-skade, sterkt oppregulert sammenlignet medkontroll og den laveste antibiotikkonsentrasjonen. I den høyeste antibiotikakonsentrasjonenviste PAU3 også oppregulering av cspD, et protein involvert i dannelse av "persister"-celler.Konklusjonen var at oppregulering av klasse C β-laktamasen ampC var hovedårsaken tilantibiotikaresistensen mot TZP. The bacterium Pseudomonas aeruginosa is a gram-negative opportunistic pathogen thatcan infect immunocompromised patients such as patients born with the recessive hereditarygenetic disease cystic fibrosis (CF). It is ubiquitously present, and is recognized by its highadaptability. P. aeruginosa is on the watch list of World Health Organization, due toantimicrobial resistance (AMR), and even multidrug resistance (MDR) emerging within thebacterial species [1]. In the cystic fibrosis lung, the pathogen is able to adapt and persist bythe characteristic thick mucus lining the epithelial cells in the CF lung. Continued antibioticexposure in an attempt to remove the pathogen, can result in the development of AMR.Understanding how the bacterium is able to achieve resistance against antibiotics is essentialfor development of novel antibiotics. During this master project, the antibiotic resistanceproperties in seven clinical isolates of P. aeruginosa have been characterized.MIC was determined against three β-lactams, Piperacillin/Tazobactam (TZP), Meropenem(MEM), and Ceftazidime (CAZ), the fluroquinolone Ciprofloxacin (CIP), the aminoglycosideTobramycin (TOB), and the polymyxin Colistin (CST). PAU5 showed to be multi-drugresistant (MDR). Interestingly, large changes in MIC value was seen between testing inMueller-Hinton Broth and RPMI-LB10. Some isolates showed increased MIC value when ina nutrient-poor medium, while others isolates showed a reduction.Genomic analysis showed all isolates had β-lactamases, as well as the various virulence factorsand resistance genes previously identified in the species. PAU1 and PAU2 did, however, nothave the efflux pump MexXY-OprM (important in efflux of aminoglycosides). The lack ofthis efflux pump could not be linked back to the result of the MIC determination for the twoisolates. Discrepancy in genes involved in two-component regulatory system (TCS) was seenbetween isolates, and PAU6 had the most genes involved in TCS which might explain thelow difference seen in MIC value for this isolate when changing the medium used for testing.Finally, proteomics analysis was performed on clinical isolates PAU3 and PAU5, which hadshowed resistance towards two and four antimicrobial agents, respectively, during MIC analy-sis. Both isolates were able to grow at the highest TZP concentration tested (512/4 μg/mL).The β-lactamase ampC was the most up-regulated protein in both isolates, but additionallyin PAU5, type VI secretion system was coexpressed with ampC when exposed to two differentconcentrations of TZP. This was not seen in PAU3. In PAU3 exposed to the highest antibi-otic concentration of TZP, ampC along with protection proteins against ROS/NO damage,was seen highly up-regulated compared to control and the lowest antibiotic concentration.In the highest antibiotic concentration, PAU3 also showed up-regulation of cspD, a proteininvolved in persister cell formation. The conclusion was that up-regulation of the class Cβ-lactamase ampC was the main reason for the antibiotic resistance against TZP.