Akvatiske miljø som spredningspunkt for antibiotikaresistente bakterier til næringskjeden. Funn av multiresistens i Sandnes kommune.

Abstract

En av nåtidens største helsetrussel globalt er kampen mot antibiotikaresistente patogene bakterier. Resistensen øker raskere enn det nye antibiotika blir produsert og introdusert innen medisinsk behandling. Antibiotikaresistens utgjør både en trussel for primær sykdomsbehandling, samt ved sekundære rutinebehandlinger slik som kirurgiske operasjoner og kreftbehandling. Dette fordi antibiotikaresistens medfører økt dødelighet, i tillegg til å være et enormt voksende økonomisk problem for det globale samfunnet. I seneste tid har også miljøets rolle i utvikling, spredning og smitte fått et viktig søkelys. Formålet med oppgaven var å undersøke vannprøver innhentet fra akvatisk ytre miljø i Rogaland fylke, med påfølgende deteksjon av resistensmekanismer, samt vurdering av spredning i næringskjeden.

Til denne oppgaven ble prøver innhentet fra 3 ulike vannkilder i Rogaland fylke. Disse vannprøvene ble filtrert og sådd ut på selektive komogene medium. Rendyrkede kolonier ble DNA ekstrahert og videre sendt til Sanger-sekvensering for analyse av 16S rDNA. For genotypisk deteksjon ble det benyttet fire ulike multipleks primermikser. Multipleks PCR-produktene ble videre kjørt på 2% agarosegelelektroforese, hvorpå prøver med båndformasjon ble ytterligere analysert ved singelpleks PCR. Tilsvarende analyser ble også utført på bakterieisolatene tilhørende Escherichia slekten for virulensgener. For å måle sensitivitet, ble 3 prøver valgt ut og testet på 9 ulike antibiotika for å undersøke antibiotikaresistens. For å bekrefte identifikasjon av bakterieisolatene, samt tilhørende resistens- og virulensgener, ble samme 3 prøver sendt til HGS med Illumina.

Totalt 23 rendyrkede kolonier ble benyttet i videre analyser. Sanger-sekvensering antydet at bakterieisolatene tilhørte slektene Escherichia, Pseudomonas, Enterobacter, Novosphingobium, Sphingomonas, Chryseobacterium, Aeromonas, Stenotrophomonas og Caulobacter. Ved multi- og singelpleks PCR ble det antydet tilstedeværelse av viktige ESBL-gener i prøvene identifisert å tilhøre Escherichia slekten. Sensitivitetstesting viste til multiresistens i prøvene antatt å være E. coli og P. aeruginosa. Helgenomsekvensering bekreftet identifikasjon til samsvar med Sanger-sekvensering, samt multiresistens. I tillegg ble det gjort funn av flere resistens- og virulensmekanismer i alle prøvene ved helgenomsekvensering.

Denne oppgaven viste til funn av multiresistente bakterier med ulike resistens- og virulensmekanismer, samt ARG, i Sandnes kommune. Ytterligere forskning på resistensmekanismer er nødvendig for å kartlegge spredning av antibiotikaresistente gener fra akvatiske miljø til næringskjeden.

One of today’s biggest global health threats is the fight against antibiotic resistant pathogenic bacteria. Resistance increases faster than new antibiotics are created and introduced as medical treatment. Therefore, antibiotic resistance poses both as a threat to primary disease treatment, as well as secondary routine treatments such as surgical operations and cancer treatment. This has led to increased mortality, in addition to being an enormously growing economic problem for the global community. In recent times, the environment’s role in development, spread and infection has also received an important spotlight. The purpose of the thesis was to analyze water samples obtained from aquatic environments in Rogaland County and examine for resistance mechanisms, as well as assessment of spread into the food chain.

For this thesis, samples were obtained from three different water sources in Rogaland County. These water samples were filtered and plated on selective chromogenic medium to detect ESBL encoding genes. Purely grown colonies were extracted, after which the 16S rDNA was sent to Sanger sequencing. For genotypic detection, 4 different multiplex primer mixes were used. The multiplex PCR products were further analyzed by 2% agarose gel electrophoresis, after which samples with band formation were further analyzed by singleplex PCR. The bacterial isolates belonging to the Escherichia genus were also tested for virulence genes. To measure the sensitivity, 3 samples were selected and tested on 9 different antibiotics. To confirm identification of the same bacterial isolates, as well as associated resistant- and viral genes, the same 3 samples were analyzed by whole genome sequencing by Illumina.

A total of 23 pure colonies were tested by further analysis. Sanger sequencing results suggested that the bacterial isolates belonged to the genus Escherichia, Pseudomonas, Enterobacter, Novosphingobium, Sphingomonas, Chryseobacterium, Aeromonas, Stenotrophomonas and Caulobacter. Multi- and singleplex PCR indicated the presence og important ESBL genes in the samples identifies as belonging to the Escherichia genus. Sensitivity testing showed multidrug resistance in the samples believed to be Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. Whole genome sequencing confirmed the identification of the sample, as well as presence og multidrug resistance. In addition, the samples were also confirmed to contain several resistance and virulence mechanisms.

This thesis showed the discovery of multidrug resistant bacteria with different resistance and virulence mechanisms, as well as ARG, in Sandnes municipality. Further research, regarding resistance mechanisms, is needed to map the spread of antibiotic-resistant bacteria from aquatic environments into the food chain.