Etablering av gendeplesjonssystemet ComRS i et penicillinresistent klinisk isolat av Streptococcus pneumoniae for studier av resistensfaktorer

Abstract

Verdens helseorganisasjon erklærte Streptococcus pneumoniae (pneumokokker) som en av 12 prioriterte patogener. Både på grunnlag av dødeligheten og smittsomheten, men og på grunn av den økende forekomsten av antibiotikaresistens, særlig mot penicillin. Penicillin etterligner penicillin-bindende proteiners (PBP) naturlige substrat for transpeptidering, og inhiberer PBPene ved å binde kovalent til enzymenes aktive sete. Dermed hemmes syntesen av den essensielle celleveggen hos bakterier. Penicillinresistens i pneumokokker er hovedsakelig forårsaket av tilegnelsen av muterte versjoner av PBPer som har lavere affinitet til penicillin. Lavaffinitets-PBPer kan utføre transpeptidering tross lavere affinitet til penicillin. Dette peker mot andre faktorer enn PBPer som i seg selv bidrar til penicillinresistensen, eller som kompenserer for tilegnelsen av mindre effektive lavaffinitets-PBPer. Disse faktorene kan være potensielle mål for å re-sensitivere resistente pneumokokker mot eksisterende penicilliner.

Et fremtidig mål utover dette masterprosjektet er å identifisere ikke-PBP faktorer som bidrar til resistens hos pneumokokker. Ved å revertere et penicillinresistent klinisk isolat ved å gjeninnføre høyaffinitets-PBPer og deretter teste om bakterien fortsatt har høyere toleranse for penicillin, er det mulig å identifisere ikke-PBP faktorer. I dette masterprosjektet har et peptidregulert system for ektopisk genuttrykk i pneumokokker, kalt ComRS-systemet, blitt etablert i et penicillinresistent klinisk isolat for å gjøre det mulig å substituere de native lavaffinitets-PBP2x, -PBP2b og -PBP1a til respektive høyaffinitets-PBPene fra en penicillinsensitiv stamme. Funksjonaliteten til ComRS-systemet i det kliniske isolatet ble testet ved å genere en mutant med ektopiske regulering av lavaffinitets-PBP2b. Deplesjon av det essensielle PBP2b-proteinet førte til redusert bakterievekst, og bekreftet at ComRS-systemet var funksjonelt.

Penicillinresistente isolater har ofte økt mengde forgrenede stempeptider i celleveggen sammenliknet med sensitive isolater. En foreslått hypotese har vært at lavaffinitets-PBPer har unormalt høy affinitet for forgrenede stempeptider. Ettersom flere studier indikerer en sammenheng mellom PBP2b og en økning av forgrenede stempeptider i celleveggen, ble lavaffinitets-PBP2b overuttrykt i det resistente isolatet ved hjelp av ComRS-systemet for å undersøke om mengden forgrenet stem-peptid ville øke dramatisk sammenliknet med en penicillinsensitiv stamme. Cellevegganalyse av denne stammen indikerte at isolat med overuttrykk av lavaffinitets-PBP2b hadde en liknende andel indirekte krysslinkinger, som den penicillinsensitive stammen. Dette viser at resistens mot penicillin kan oppnås i pneumokokker uten at mengde forgrenede stempeptider i celleveggen er høyere enn i en sensitiv stamme.

Ligasen MurM katalyserer binding av første aminosyre i forgreinede stempeptider på lipid II (forløpermolekyl for peptidoglykan). Det er tidligere vist at penicillinresistente isolater med økt mengde forgreinede stempeptider uttrykker en mutert murM-versjon, og at delesjon av dette genet fører til en dramatisk reduksjon av resistensnivået. Det resistente isolatet som er studert i dette prosjektet uttrykker en normal versjon av MurM, og kan være en forklaring på at mengden forgrenede stempeptider i celleveggen var tilnærmet lik en sensitiv pneumokokk. Videre ble det konstruert en murM-mutant for å teste om en normal versjon av MurM var viktig for resistensnivået til isolatet. MIC-test viste at resistensen mot penicillin ble signifikant redusert. Dette kan bety at det ikke bare er i isolater med mutert MurM og høyt forgreinet cellevegg at proteinet er viktig for å opprettholde penicillinresistens, men også at en vanlig MurM er viktig i pneumokokker med en tilnærmet normal stempeptidkomposisjon. Virkningsmekanismene til MurM er enda ukjent, men det ble i denne studien sannsynligvis utelukket at den påvirker affiniteten mellom penicillin og PBPene. Uansett, reduserer inhibering av MurM penicillinresistensen betydelig. Dermed er det et stort potensial for bruk av et inhiberende stoff mot MurM i kombinasjon med penicillinbehandling av infeksjoner forårsaket av penicillinresistente pneumokokker.

The World Health Organization declared Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) as one of 12 prioritized pathogens. This was based on both its mortality and morbidity, as well as the increasing prevalence of antibiotic resistance, particularly against penicillin. Penicillin mimics the natural substrate of penicillin-binding proteins (PBPs) for transpeptidation and inhibits PBPs by covalently binding to their active site. This inhibits the synthesis of the essential cell wall in bacteria. Penicillin resistance in pneumococci is mainly caused by the acquisition of mutated versions of PBPs that have lower affinity for penicillin. Despite having lower affinity, these low-affinity PBPs can still carry out transpeptidation. This suggests that factors other than PBPs themselves contribute to penicillin resistance or compensate for the acquisition of less effective low-affinity PBPs. These factors could be potential targets for resensitizing resistant pneumococci to existing penicillins.

A future goal beyond this master's project is to identify non-PBP factors that contribute to resistance in pneumococci. By reversing the penicillin resistance of a clinical isolate through reintroduction of high-affinity PBPs and then testing if the bacteria still exhibit higher tolerance to penicillin, it is possible to identify non-PBP factors. In this master's project, a peptideregulated system for ectopic gene expression in pneumococci, called the ComRS system, has been established in a penicillin-resistant clinical isolate to enable substitution of the native lowaffinity PBP2x, PBP2b, and PBP1a, with their respective high-affinity PBPs from a penicillinsensitive strain. The functionality of the ComRS system in the clinical isolate was tested by generating a mutant with ectopic regulation of low-affinity PBP2b. Depletion of the essential PBP2b protein resulted in reduced bacterial growth, confirming the functionality of the ComRS system.

Penicillin-resistant isolates often have an increased amount of branched stem peptides in the cell wall compared to sensitive isolates. A proposed hypothesis has been that low-affinity PBPs have abnormally high affinity for branched stem peptides. As several studies indicate a connection between PBP2b and an increase in branched stem peptides in the cell wall, lowaffinity PBP2b was overexpressed in the resistant isolate using the ComRS system to investigate whether the amount of branched stem peptides would increase dramatically compared to a penicillin-sensitive strain. Cell wall analysis of this strain indicated that the isolate with overexpression of low-affinity PBP2b had a similar proportion of indirect crosslinking as the penicillin-sensitive strain. This demonstrates that resistance to penicillin can be achieved in pneumococci without the amount of branched stem peptides in the cell wall being higher than in a sensitive strain.

The ligase MurM catalyzes the binding of the first amino acid in branched stem peptides to lipid II (the precursor molecule for peptidoglycan). It has been previously shown that penicillinresistant isolates with an increased amount of branched stem peptides express a mutated version of MurM, and deletion of this gene leads to a dramatic reduction in the level of resistance. The resistant isolate studied in this project expresses a normal version of MurM, which could explain why the amount of branched stem peptides in the cell wall was approximately similar to that of a sensitive pneumococcus. Furthermore, a ΔmurM mutant was constructed to test if a normal version of MurM was important for the resistance level of the isolate. MIC assay showed a significant reduction in resistance to penicillin. This suggests that not only in isolates with mutated MurM and highly branched cell walls, but also in pneumococci with an almost normal stem peptide composition, a regular MurM is important for maintaining penicillin resistance. The mechanisms of action of MurM are still unknown, but in this study, it was likely excluded that it affects the affinity between penicillin and PBPs. Nonetheless, inhibition of MurM significantly reduces penicillin resistance. Thus, there is great potential for using an inhibitory compound against MurM in combination with penicillin treatment for infections caused by penicillin-resistant pneumococci.