Etablering av gendeplesjonssystemet ComRS i et penicillinresistent klinisk isolat av Streptococcus pneumoniae for studier av resistensfaktorer
Abstract
Verdens helseorganisasjon erklærte Streptococcus pneumoniae (pneumokokker) som en av 12prioriterte patogener. Både på grunnlag av dødeligheten og smittsomheten, men og på grunn avden økende forekomsten av antibiotikaresistens, særlig mot penicillin. Penicillin etterlignerpenicillin-bindende proteiners (PBP) naturlige substrat for transpeptidering, og inhibererPBPene ved å binde kovalent til enzymenes aktive sete. Dermed hemmes syntesen av denessensielle celleveggen hos bakterier. Penicillinresistens i pneumokokker er hovedsakeligforårsaket av tilegnelsen av muterte versjoner av PBPer som har lavere affinitet til penicillin.Lavaffinitets-PBPer kan utføre transpeptidering tross lavere affinitet til penicillin. Dette pekermot andre faktorer enn PBPer som i seg selv bidrar til penicillinresistensen, eller somkompenserer for tilegnelsen av mindre effektive lavaffinitets-PBPer. Disse faktorene kan værepotensielle mål for å re-sensitivere resistente pneumokokker mot eksisterende penicilliner.
Et fremtidig mål utover dette masterprosjektet er å identifisere ikke-PBP faktorer som bidrar tilresistens hos pneumokokker. Ved å revertere et penicillinresistent klinisk isolat ved ågjeninnføre høyaffinitets-PBPer og deretter teste om bakterien fortsatt har høyere toleranse forpenicillin, er det mulig å identifisere ikke-PBP faktorer. I dette masterprosjektet har etpeptidregulert system for ektopisk genuttrykk i pneumokokker, kalt ComRS-systemet, blittetablert i et penicillinresistent klinisk isolat for å gjøre det mulig å substituere de nativelavaffinitets-PBP2x, -PBP2b og -PBP1a til respektive høyaffinitets-PBPene fra enpenicillinsensitiv stamme. Funksjonaliteten til ComRS-systemet i det kliniske isolatet ble testetved å genere en mutant med ektopiske regulering av lavaffinitets-PBP2b. Deplesjon av detessensielle PBP2b-proteinet førte til redusert bakterievekst, og bekreftet at ComRS-systemetvar funksjonelt.
Penicillinresistente isolater har ofte økt mengde forgrenede stempeptider i celleveggensammenliknet med sensitive isolater. En foreslått hypotese har vært at lavaffinitets-PBPer harunormalt høy affinitet for forgrenede stempeptider. Ettersom flere studier indikerer ensammenheng mellom PBP2b og en økning av forgrenede stempeptider i celleveggen, blelavaffinitets-PBP2b overuttrykt i det resistente isolatet ved hjelp av ComRS-systemet for åundersøke om mengden forgrenet stem-peptid ville øke dramatisk sammenliknet med enpenicillinsensitiv stamme. Cellevegganalyse av denne stammen indikerte at isolat medoveruttrykk av lavaffinitets-PBP2b hadde en liknende andel indirekte krysslinkinger, som denpenicillinsensitive stammen. Dette viser at resistens mot penicillin kan oppnås i pneumokokkeruten at mengde forgrenede stempeptider i celleveggen er høyere enn i en sensitiv stamme.
Ligasen MurM katalyserer binding av første aminosyre i forgreinede stempeptider på lipid II(forløpermolekyl for peptidoglykan). Det er tidligere vist at penicillinresistente isolater med øktmengde forgreinede stempeptider uttrykker en mutert murM-versjon, og at delesjon av dettegenet fører til en dramatisk reduksjon av resistensnivået. Det resistente isolatet som er studerti dette prosjektet uttrykker en normal versjon av MurM, og kan være en forklaring på atmengden forgrenede stempeptider i celleveggen var tilnærmet lik en sensitiv pneumokokk.Videre ble det konstruert en murM-mutant for å teste om en normal versjon av MurM varviktig for resistensnivået til isolatet. MIC-test viste at resistensen mot penicillin ble signifikantredusert. Dette kan bety at det ikke bare er i isolater med mutert MurM og høyt forgreinetcellevegg at proteinet er viktig for å opprettholde penicillinresistens, men også at en vanligMurM er viktig i pneumokokker med en tilnærmet normal stempeptidkomposisjon.Virkningsmekanismene til MurM er enda ukjent, men det ble i denne studien sannsynligvisutelukket at den påvirker affiniteten mellom penicillin og PBPene. Uansett, reduserer inhiberingav MurM penicillinresistensen betydelig. Dermed er det et stort potensial for bruk av etinhiberende stoff mot MurM i kombinasjon med penicillinbehandling av infeksjoner forårsaketav penicillinresistente pneumokokker. The World Health Organization declared Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) as one of12 prioritized pathogens. This was based on both its mortality and morbidity, as well as theincreasing prevalence of antibiotic resistance, particularly against penicillin. Penicillin mimicsthe natural substrate of penicillin-binding proteins (PBPs) for transpeptidation and inhibitsPBPs by covalently binding to their active site. This inhibits the synthesis of the essential cellwall in bacteria. Penicillin resistance in pneumococci is mainly caused by the acquisition ofmutated versions of PBPs that have lower affinity for penicillin. Despite having lower affinity,these low-affinity PBPs can still carry out transpeptidation. This suggests that factors other thanPBPs themselves contribute to penicillin resistance or compensate for the acquisition of lesseffective low-affinity PBPs. These factors could be potential targets for resensitizing resistantpneumococci to existing penicillins.
A future goal beyond this master's project is to identify non-PBP factors that contribute toresistance in pneumococci. By reversing the penicillin resistance of a clinical isolate throughreintroduction of high-affinity PBPs and then testing if the bacteria still exhibit higher toleranceto penicillin, it is possible to identify non-PBP factors. In this master's project, a peptideregulated system for ectopic gene expression in pneumococci, called the ComRS system, hasbeen established in a penicillin-resistant clinical isolate to enable substitution of the native lowaffinity PBP2x, PBP2b, and PBP1a, with their respective high-affinity PBPs from a penicillinsensitive strain. The functionality of the ComRS system in the clinical isolate was tested bygenerating a mutant with ectopic regulation of low-affinity PBP2b. Depletion of the essentialPBP2b protein resulted in reduced bacterial growth, confirming the functionality of the ComRSsystem.
Penicillin-resistant isolates often have an increased amount of branched stem peptides in thecell wall compared to sensitive isolates. A proposed hypothesis has been that low-affinity PBPshave abnormally high affinity for branched stem peptides. As several studies indicate aconnection between PBP2b and an increase in branched stem peptides in the cell wall, lowaffinity PBP2b was overexpressed in the resistant isolate using the ComRS system toinvestigate whether the amount of branched stem peptides would increase dramaticallycompared to a penicillin-sensitive strain. Cell wall analysis of this strain indicated that theisolate with overexpression of low-affinity PBP2b had a similar proportion of indirect crosslinking as the penicillin-sensitive strain. This demonstrates that resistance to penicillin can beachieved in pneumococci without the amount of branched stem peptides in the cell wall beinghigher than in a sensitive strain.
The ligase MurM catalyzes the binding of the first amino acid in branched stem peptides tolipid II (the precursor molecule for peptidoglycan). It has been previously shown that penicillinresistant isolates with an increased amount of branched stem peptides express a mutated versionof MurM, and deletion of this gene leads to a dramatic reduction in the level of resistance. Theresistant isolate studied in this project expresses a normal version of MurM, which couldexplain why the amount of branched stem peptides in the cell wall was approximately similarto that of a sensitive pneumococcus. Furthermore, a ΔmurM mutant was constructed to test if anormal version of MurM was important for the resistance level of the isolate. MIC assay showeda significant reduction in resistance to penicillin. This suggests that not only in isolates withmutated MurM and highly branched cell walls, but also in pneumococci with an almost normalstem peptide composition, a regular MurM is important for maintaining penicillin resistance.The mechanisms of action of MurM are still unknown, but in this study, it was likely excludedthat it affects the affinity between penicillin and PBPs. Nonetheless, inhibition of MurMsignificantly reduces penicillin resistance. Thus, there is great potential for using an inhibitorycompound against MurM in combination with penicillin treatment for infections caused bypenicillin-resistant pneumococci.