Characterization of the protein complex EloR-KhpA-MltG, which controls cell elongation in Streptococcus pneumoniae
Master thesis
Permanent lenke
https://hdl.handle.net/11250/2825371Utgivelsesdato
2021Metadata
Vis full innførselSamlinger
- Master's theses (KBM) [940]
Sammendrag
Streptococci are ovococci shaped Gram-positive bacteria which are typically arranged in pairs or chains. Streptococcus pneumoniae is recognized as a human pathogen which can cause disease that ranges from middle ear infections to invasive infections and is a major contributor to morbidity and mortality especially among children, elderly, and immune compromised individuals. Antibiotics have been an instrumental defence against these kinds of infections, but the worldwide increase in antibiotic resistant bacterial strains are of great concern and requires attention. To discover new potential drug targets, we need better understanding of different essential cellular processes, including cell-division.
The shape of S. pneumoniae is determined by the synchronised actions of the elongasome and the divisome, creating a protective layer of peptidoglycan (PG), that envelops the cell membrane. The divisome synthesizes the septal PG, that divides the cell into two new daughter cells, while the elongasome expands PG in the longitudinal direction, contributing to the elongated shape of the cell. PBP2b/RodA and PBP2x/FtsW are essential transpeptidase/transglycosylase pairs that incorporate new PG into the existing PG sacculus and are considered the cores of the elongasome and divisome, respectively. The actions of the two machineries must be coordinated throughout the cell cycle, but detailed knowledge of this is lacking. It was recently discovered that elongation is regulated by two RNA binding proteins, EloR and KhpA, which forms a complex that work closely with the Ser/Thr kinase StkP. StkP functions by phosphorylating its targets in PG synthesis to facilitate switching between septal and peripheral synthesis. StkP also regulates the activity of EloR through phosphorylation. Studies have found that EloR/KhpA localizes to midcell, and that the presence of KhpA at midcell is fully dependent upon EloR. It has also been published that the deletion of PBP2b creates suppressor mutations in the genes coding eloR, khpA and mltG, suggesting a functional connection between these. We have shown that EloR is dependent on its Jag domain to locate to midcell and interact with the essential lytic transglycosylase MltG, also known as a part of the elongasome. In this work, fluorescence microscopy and protein-protein interaction assays were employed to further explore the interaction between EloR and MltG in S. pneumoniae. Also, co-immunoprecipitation assays and gel filtration analysis was performed to verify the protein complex formation of MltG and EloR. Fluorescence microscopy demonstrated that the Jag domain of EloR is critical for midcell localization and its interaction with MltG, and co-immunoprecipitation confirmed the EloR-MltG interaction in vivo. The results suggest that MltG is responsible for the recruitment of the EloR/KhpA complex to the division zone. Streptokokker er en ovococci-formet Gram-positiv bakterie som vanligvis vokser i par eller i kjeder. Streptococcus pneumoniae er en kjent patogen hos mennesker og kan forårsake sykdom som variere mellom infeksjon i mellomøret til invasive infeksjoner og er en stor bidragsyter til sykdom og død blant barn, eldre og de med svakt immunforsvar. Antibiotika er et viktig forsvar mot slike sykdommer, men den verdensomspennende økningen av antibiotikaresistente bakterier er urovekkende og krever oppmerksomhet. For å kunne oppdage nye mål for antibiotika må vi få bedre kjennskap til ulike essensielle cellulære prosesser, inkludert celledeling.
Formen til Streptococcus pneumoniae bestemmes av de synkroniserte handlingene til elongasomet og divisomet, som danner et beskyttende lag av peptidoglycan (PG) som omslutter cellemembranen. Divisomet syntetiserer septal PG som føre til at cellen deler seg i to nye datterceller, mens elongasomet ekspanderer PG i lengderetning, noe som er med på å bidra til den elongerte celleformen. PBP2b/RodA og PBP2x/FtsW er essensielle transpeptidaser/transglycosylase-par som inkorporerer nytt PG inn til eksisterende PG og blir betegnet som kjernen av elongasomet og divisomet. Dette maskineriet må koordineres gjennom cellesyklusen, men detaljert informasjon om dette mangler. Det har nylig blitt oppdaget at elongeringen er regulert av to RNA-bindende protein, EloR og KhpA, som danner et kompleks som jobber tett med Ser/Thr kinasen StkP. StkP fungerer ved å fosforylere dens mål under PG syntesen for å bytte mellom septal og perifer syntese. StkP regulerer også aktiviteten til EloR gjennom fosforylering. Studier har vist at EloR/KhpA lokaliseres til midten av cellen og at tilstedeværelsen av KhpA i denne delen av cellen er avhengig av EloR. Publikasjoner viser også at sletting av PBP2b danner suppressormutasjoner i genene eloR, khpA and mltG, som tyder på en funksjonell forbindelse mellom disse. Vi har vist at EloR er avhengig av Jag domenet sitt for å lokalisere til midten av cellen og interagerer med den essensielle transglykosylasen MltG, også kjent som en del av elongasomet. I dette arbeidet har fluorescensmikroskopering og protein-protein interaksjonsstudier blitt brukt til å utforske interaksjonen mellom EloR og MltG i S. pneumoniae. Også, co-immunoprecipitation studier og gelfiltreringsanalyser ble gjennomført for å verifisere proteinkompleksformasjonen av MltG og EloR. Fluorescensmikroskopi viste at Jag-domenet av EloR er kritisk for lokalisering til midten av cellen og dens interaksjon med MltG, og co-immunoprecipitation bekreftet EloR-MltG interaksjonen in vivo. Disse resultatene viser at MltG er ansvarlig for rekrutteringen av EloR/KhpA-komplekset til delingssonen.