Benchmarking of metagenomic classification tools and storage stability of bioaerosol samples

Abstract

Air is a microbial habitat of crucial importance for public health. As such it is relevant for detection of potential epidemic or biothreat agents. The study of microbiological diversity in air through metagenomic analysis is a field under rapid development, and demands more knowledge. The work presented in this thesis investigated the current procedures used in metagenomic analysis of air samples, and consists of two parts. The first part assessed how long-time storage at low temperatures affects the stability of DNA concentration of filter-based air samples. Qubit and qPCR targeting the 16S rRNA gene were used to measure the DNA concentration. No evidence was found suggesting a detrimental effect of filter storage at – 80 °C. However, the findings may suggest negative effect of repeated freeze-thaw cycles on the yield of purified DNA. The second part assessed the performance of three metagenomic classification tools for creation of taxonomic profiles of air samples: Kraken 2, One Codex and Kaiju. The testing was conducted on various datasets. The results showed that Kraken 2 is the superior classification tool of well-studied species. However, Kraken 2 performed poorly on more complex datasets closer resembling the biological composition in air samples, due to inadequacies in the reference database. The classification of real air samples showed substantial variation between the profiles made by the tools. These findings further emphasise the need for improvements of the reference databases by adding more species specific for air, which should be a key objective for further work. There could also be improvements from altering the lowest common ancestor approach implemented in the classification algorithms, which seems to be a limiting factor for the taxonomic resolution.

Luft er et mikrobielt habitat med stor betydning for folkehelsen, med relevans for deteksjon av potensielle smittestoffer som kan føre til epidemiske utbrudd. Studiet av mikrobiell diversitet i luft ved metagenomisk analyse er et forskningsfelt i rask endring, og det kreves mer kunnskap. Arbeidet som er presentert i denne oppgaven tok for seg prosedyrene brukt for metagenomanalyser av luft, og består av to deler. Den første delen tok for seg hvordan langtidslagring på lave temperaturer påvirker DNA-konsentrasjonen av filterbaserte luftprøver. Qubit og qPCR basert på 16S rRNA-genet ble brukt til å måle DNA-konsentrasjonen. Det ble ikke funnet bevis for at lagring på -80°C opp til syv måneder har negativ effekt på konsentrasjonen. Resultatene antyder imidlertid negativ effekt fra gjentatte tine-fryse-sykluser på DNA-konsentrasjonen av renset DNA. I den andre delen vurdertes prestasjonen av tre metagenomiske klassifiaksjonsverktøy brukt til å lage taksonomiske profiler av luft: Kraken 2, One Codex og Kaiju. Testingen ble gjennomført på ulike typer datasett. Resultatene viste at Kraken 2 gjør den beste klassifiseringen på velstuderte arter, men presterte dårligst på mer komplekse datasett som ligner mer på artene funnet i luft. Dette skyldes mangler i referansedatabasen. Klassifikasjonen av reelle luftprøver viste betydelige avvik mellom profilene fra de testede verktøyene. Disse funnene understreker at databasene må utbedres ved å legge til arter mer spesifikke for luft, som bør være et hovedpunkt for videre arbeid. «Least common ancestor»-tilnærmingen som brukes av verktøyene kan også forbedres, da det ser ut til å være en begrensende faktor for den taksonomiske oppløsningen.