Establishment of multiplexed reduced representation bisulfite sequencing protocol on T-cells from rheumatoid arthritis patients

Abstract

DNA methylation is an important epigenetic mark with a regulatory effect on the expression of genes. It has also been shown that individuals change their DNA methylation pattern over time. In mammals, methylation only occurs in cytosines, and almost exclusively in the CpG context. Differential methylation has been shown to be important for the development and differentiation of pluripotent stem cells. Rheumatoid arthritis (RA) patients have also been shown as having T-cells with reduced methylation compared to healthy controls. RA is a severe disease associated with great pain and disability and affects about 0.5-1% of the population. In this thesis, the process of establishing a protocol for multiplexed reduced representation bisulfite sequencing (mRRBS) in order to create a methylome profile of RA patients is described. The extracted DNA was cleaved by a restriction enzyme, MspI, which enriched for areas of the genome containing CpG islands. This DNA was then treated with sodium bisulfite which converted all unmethylated cytosines to uracils, while leaving the methylated cytosines intact. Through PCR amplification, and subsequent sequencing, all unmethylated cytosines was read by the sequencer as thymines, while methylated cytosines was read as normal. Four different DNA extraction methods were tested, as well as two DNA cleanup protocols. It was an aim in this study to extract RNA and protein, in addition to DNA, from the same sample, to enable further studies. The best results were achieved through the use of the QIAamp DNA micro kit, but comparable results were achieved by extracting the DNA with the Norgen DNA/RNA/Protein purification plus kit followed by a cleanup with the QIAamp DNA micro kit. In this thesis, it has been demonstrated that the established mRRBS protocol could generate methylome profiles of T cells from RA patients with a bisulfite conversion ratio >99.9%, and sequence alignment of at least 60%. An exploratory analysis of CD4+ T cells showed that the methylation level largely followed the expected pattern of high degree of methylation for genes with low expression, and vice versa, but also supported the notion that other regulatory factors were involved in addition to methylation.

DNA metylering er en viktig epigenetisk faktor med en regulatorisk effekt over ekspresjonen av gener. Det har også blitt påvist at metyleringsmønsteret i DNAet til et individ vil forandre seg over tid. I pattedyr forekommer DNA metylering kun på cytosiner, og nesten alltid i en CpG kontekst. Differensiell metylering har blitt vist å være viktig under utvikling og differensiering av pluripotente stamceller. I pasienter med revmatoid artritt (RA) har det blitt påvist at T-celler har redusert metylering i forhold til hos friske kontroller. RA er en alvorlig sykdom assosiert med sterke smerter og funksjonshemming. Anslagsvis 0,5-1% av befolkningen er rammet av denne sykdommen. Arbeidet med å etablere en protokoll for multiplekset begrenset representativ bisulfittsekvensering (mRRBS), for å kunne produsere metylomprofiler for pasienter med RA er beskrevet i denne oppgaven. Det ekstraherte DNAet ble kløyvd med restriksjonsenzymet MspI. Dette restriksjonsenzymet anriket for genomiske områder som inneholdt CpG øyer. DNAet ble så behandlet med natrium bisulfitt som konverterte alle umetylerte cytosiner til uraciler, mens metylerte cytosiner sto uberørt. Gjennom PCR amplifikasjon etterfulgt av sekvensering, ble alle de umetylerte cytosinene lest som tyminer av sekvensatoren og metylerte cytosiner lest som normalt. Fire forskjellige DNA ekstraksjonsmetoder ble testet i tillegg til to opprensingsprotokoller. Det var i denne studien et mål å få ekstrahert RNA og protein i tillegg til DNA fra det samme prøvematerialet, slik at videre studier kunne gjennomføres på et senere tidspunkt. Det beste resultatet ble oppnådd ved bruk av QIAamp DNA micro kit, men sammenlignbare resultater ble oppnådd fra DNA ekstraksjon med Norgen DNA/RNA/Protein purification plus kit etterfulgt av en opprensing med QIAamp DNA micro kit. Denne oppgaven har demonstrert at den etablerte mRRBS protokollen kunne generere metylomprofiler av T-celler fra RA pasienter med en oppnådd bisulfittkonverteringsrate på >99,9% og sekvenssammenstilling på minimum 60%. En undersøkende analyse av CD4+ T celler viste at metyleringsnivået stort sett fulgte det forventede mønsteret med høy metylering i lavt utrykte gener, og motsatt, men støttet også teorien om at andre regulerende faktorer er involvert i tillegg til metylering.