Establishment of multiplexed reduced representation bisulfite sequencing protocol on T-cells from rheumatoid arthritis patients
Master thesis
Permanent lenke
http://hdl.handle.net/11250/2398698Utgivelsesdato
2016-08-10Metadata
Vis full innførselSamlinger
- Master's theses (KBM) [885]
Sammendrag
DNA methylation is an important epigenetic mark with a regulatory effect on the expression
of genes. It has also been shown that individuals change their DNA methylation pattern over
time. In mammals, methylation only occurs in cytosines, and almost exclusively in the CpG
context. Differential methylation has been shown to be important for the development and
differentiation of pluripotent stem cells. Rheumatoid arthritis (RA) patients have also been
shown as having T-cells with reduced methylation compared to healthy controls. RA is a
severe disease associated with great pain and disability and affects about 0.5-1% of the
population.
In this thesis, the process of establishing a protocol for multiplexed reduced representation
bisulfite sequencing (mRRBS) in order to create a methylome profile of RA patients is
described. The extracted DNA was cleaved by a restriction enzyme, MspI, which enriched for
areas of the genome containing CpG islands. This DNA was then treated with sodium
bisulfite which converted all unmethylated cytosines to uracils, while leaving the methylated
cytosines intact. Through PCR amplification, and subsequent sequencing, all unmethylated
cytosines was read by the sequencer as thymines, while methylated cytosines was read as
normal.
Four different DNA extraction methods were tested, as well as two DNA cleanup protocols.
It was an aim in this study to extract RNA and protein, in addition to DNA, from the same
sample, to enable further studies. The best results were achieved through the use of the
QIAamp DNA micro kit, but comparable results were achieved by extracting the DNA with
the Norgen DNA/RNA/Protein purification plus kit followed by a cleanup with the QIAamp
DNA micro kit. In this thesis, it has been demonstrated that the established mRRBS protocol
could generate methylome profiles of T cells from RA patients with a bisulfite conversion
ratio >99.9%, and sequence alignment of at least 60%. An exploratory analysis of CD4+ T
cells showed that the methylation level largely followed the expected pattern of high degree
of methylation for genes with low expression, and vice versa, but also supported the notion
that other regulatory factors were involved in addition to methylation. DNA metylering er en viktig epigenetisk faktor med en regulatorisk effekt over ekspresjonen
av gener. Det har også blitt påvist at metyleringsmønsteret i DNAet til et individ vil forandre
seg over tid. I pattedyr forekommer DNA metylering kun på cytosiner, og nesten alltid i en
CpG kontekst. Differensiell metylering har blitt vist å være viktig under utvikling og
differensiering av pluripotente stamceller. I pasienter med revmatoid artritt (RA) har det blitt
påvist at T-celler har redusert metylering i forhold til hos friske kontroller. RA er en alvorlig
sykdom assosiert med sterke smerter og funksjonshemming. Anslagsvis 0,5-1% av
befolkningen er rammet av denne sykdommen.
Arbeidet med å etablere en protokoll for multiplekset begrenset representativ
bisulfittsekvensering (mRRBS), for å kunne produsere metylomprofiler for pasienter med RA
er beskrevet i denne oppgaven. Det ekstraherte DNAet ble kløyvd med restriksjonsenzymet
MspI. Dette restriksjonsenzymet anriket for genomiske områder som inneholdt CpG øyer.
DNAet ble så behandlet med natrium bisulfitt som konverterte alle umetylerte cytosiner til
uraciler, mens metylerte cytosiner sto uberørt. Gjennom PCR amplifikasjon etterfulgt av
sekvensering, ble alle de umetylerte cytosinene lest som tyminer av sekvensatoren og
metylerte cytosiner lest som normalt.
Fire forskjellige DNA ekstraksjonsmetoder ble testet i tillegg til to opprensingsprotokoller.
Det var i denne studien et mål å få ekstrahert RNA og protein i tillegg til DNA fra det samme
prøvematerialet, slik at videre studier kunne gjennomføres på et senere tidspunkt. Det beste
resultatet ble oppnådd ved bruk av QIAamp DNA micro kit, men sammenlignbare resultater
ble oppnådd fra DNA ekstraksjon med Norgen DNA/RNA/Protein purification plus kit
etterfulgt av en opprensing med QIAamp DNA micro kit. Denne oppgaven har demonstrert at
den etablerte mRRBS protokollen kunne generere metylomprofiler av T-celler fra RA
pasienter med en oppnådd bisulfittkonverteringsrate på >99,9% og sekvenssammenstilling på
minimum 60%. En undersøkende analyse av CD4+ T celler viste at metyleringsnivået stort
sett fulgte det forventede mønsteret med høy metylering i lavt utrykte gener, og motsatt, men
støttet også teorien om at andre regulerende faktorer er involvert i tillegg til metylering.