Ex vivo digestion of bovine milk with genetic variants A1 and A2 of beta-casein and identification of bioactive peptides

Abstract

Milk-derived bioactive peptides (BAPs) have shown to possess physiological effects linked to the development of non-communicable diseases, such as cardiovascular disease, cancer and diabetes. These peptides lie within the sequence of the precursor protein, and can be released by enzymatic proteolysis during gastrointestinal digestion. As proteolytic enzymes have preferences for cleavage at specific amino acids, genetic polymorphism can affect the release of BAPs during digestion, due to amino acid substitution. Bioactive properties within a protein are therefore suggested to be dependent on the genetic variants. The aim of the study was to investigate whether different variants of beta-casein (CN), such as A1 and A2, give rise to peptides of different lengths and with different bioactivities during digestion. Beta-Casein was purified from bovine milk with homozygous genetic variant A1, A2 and I, and the heterozygous type A2F. Skimmed milk and purified beta-CN were digested in a static ex vivo model with human gastrointestinal juices, with subsequent identification of peptides released. Sampling was done after 30 and 60 min of gastric digestion, and after 5, 30 and 120 min of duodenal digestion. Degree of hydrolysis (DH) was measured at for each sampling point, and showed to increase substantially in the duodenal phase; however, there were no significant differences (p<0.05) in the DH of the genetic variants of beta-CN. Fractions of undigested proteins remaining in the gastric and duodenal phase were analysed by capillary- and gel electrophoresis. The digestion pattern showed high degradation of CNs and high resistance of whey protein degradation after 60 min of gastric digestion. All proteins were degraded after duodenal digestion. Mass spectrometry analyses of peptides released during digestion revealed that amino acid substitution affected the proteolytic hydrolysis to some extent, where the peptide f(60-68) was exclusively identified from variants containing proline at position 67. Most strikingly, the opioid peptide BCM7, f(60-66), was identified from both A1 and A2 genetic variant of beta-CN after 120 min duodenal digestion. In conclusion, genetic variation of beta-CN may affect the proteolysis during digestion; however, the release of BCM7 does not seem to be linked solely to variant A1 as previously suggested in the literature. Further quantification of BCM7 formed during digestion is needed to establish any significant differences between the variants.

Bioaktive peptider (BAP) som stammer fra melk har vist seg å besitte fysiologiske egenskaper forbundet med utvikling av ikke-smittsomme sykdommer som hjerte- og karsykdommer, kreft og diabetes. Disse peptidene ligger forplantet i det intakte proteinet, og kan bli frigjort fra den native sekvensen ved proteolyse under fordøyelse. Ettersom proteolytiske enzymer besitter spesifikke preferanser for kløyving kan proteiners polymorfisme påvirke frigjørelse av bioaktive peptider grunnet aminosyresubstitusjon i proteinsekvensen. Proteinets bioaktive egenskaper er derfor antatt å være avhengig av den genetiske varianten av proteinet. Hensikten med denne studien var å undersøke om ulike varianter av beta-kasein (KN), A1 og A2, påvirker frigjørelse av peptider etter fordøyelse. Beta-Kasein ble renset fra kumelk homozygot for variant A1, A2 og I, i tillegg til heterozygot A2F. Renset beta-KN og skummet melk ble fordøyd i en statisk ex vivo modell med human mage- og tarmsaft, med påfølgende identifisering av frigitte peptider. Uttak ved forskjellige fordøyelsestrinn ble gjort etter 30 og 60 min i magefasen, og etter 5, 30 og 120 min i tarmfasen. Hydrolysegraden ble undersøkt for vært fordøyelsestrinn og viste en markant økning fra mage- til tarmfasen. Det var derimot ingen signifikant forskjell (p<0.05) i hydrolysegrad mellom de ulike genetiske variantene av beta-KN. Ufordøyde proteiner ble undersøkt ved hjelp av kapillær- og gelelektroforese. Nedbrytningsgraden av KN var høy, mens myseproteinene var relativt resistente mot nedbryting etter 60 min fordøyelse i mage. Alle proteiner var brutt ned etter fordøyelse i tarm. Massespektrometriske analyser av peptider frigitt under fordøyelse bekreftet at aminosyresubstitusjon påvirker proteolytisk hydrolyse i noen grad, der peptidet f(60-68) ble utelukkende identifisert fra beta-KN variant med prolin i posisjon 67. Det mest oppsiktsvekkende var identifisering av peptidet BCM7, f(60-66), fra både A1 og A2 variant av beta-KN etter 120 min fordøyelse i tarm. Resultatene tyder på at genetisk variasjon av beta-KN kan påvirke proteolysen under fordøyelsen, derimot viser frigjøring av BCM7 ikke å være avhengig av beta-KN variant A1. Videre kvantifisering av identifisert BCM7 etter fordøyelse er nødvendig for å påvise om det er en signifikant forskjell mellom de genetiske variantene.