Repetitive regioner i Lactobacillus reuteri celle - og mucusbindende protein A (CmbA) - studier av variasjon og betydning for adhesjon til intestinale celler

Abstract

Hovedmål i dette arbeidet var å studere om den hypervariable repeterte regionen i den C-terminale delen av CmbA har betydning for adhesjon til intestinale epitelceller, og om forskjellige vekstfaser og mediekomponenter kan påvirke uttrykket av cmbA-genet vedrørende disse repetitive regionene. I dette arbeidet ble det brukt to syntetisk produserte varianter av cmbA-genet, tilstede i plasmidene pUC57-cmbA3 og pUC57-cmbA4. Det lyktes å transformere cmbA3-varianten inn i L. reuteri 6475cmbA- i en konstruksjon med vektor pSIP411. Stammen ble sammen med pSIP-cmbA1 testet for adhesjon til Caco-2. Siden det ikke lyktes å finne positive transformanter av cmbA4 i hverken Lc. lactis og E. coli PK401 kan det tenkes at genet, som er 3.4 kb, kanskje er for stort, men også at genet har egenskaper som gjør det vanskelig å introdusere i ulike stammer. Siden antall repetitive regioner er det som skiller genene kan det hende at akkurat denne ekstra delen i cmbA4 forårsaker vanskelighetene. DSM20016 og L. reuteri 6475 ble benyttet i vekstforsøk for å analysere de repetitive regionene i cmbA. Galle og mucin ble brukt som mediekomponenter for å se om disse påvirket resultatet. DSM20016 og 6475 tilsatt galle vokste betydelig saktere enn de andre bakteriekulturene, midlertidig økte veksten ved tilsats av MOPS-buffer. Det kan antas at MOPS hindrer stor hemming i bakteriekulturene med galle. Fra PCR-produkt var det ingen signifikante forskjeller i de repetitive mønstrene, men i DSM20016 kan det tenkes at mucin kanskje induserer større variasjon og eventuell forskjell til binding tatt i betraktning at mucin hadde høyere utbytte i båndene på slutten av vekstforsøket enn kontrollen. I 6475 har kontrollen antydninger til flere bånd enn 6475 med mucin og galle i tillegg til et høyere utbytte i hvert bånd. Dette kan tyde på at mucin eller galle hemmer evnen til større variasjon i repeterende regioner i 6475.

The overall aim in this study was to see if the hypervariable repetitive region in the C - terminal part of CmbA h as significance f or adhesion to intestinal cells and if different growth phases and media components can affect expressions in the cmbA - gene regarding these repetitive regions. Two variants of the cmbA - gene were constructed, present in the plasmids pUC57 - cmbA3 and pUC57 - cmbA4 . Transformation of the cmbA - ge ne in to L. reuteri 6475 cmbA - in a construction with the pSIP 411 - vector succeeded . T his gene, as well as pSIP – cmbA1, was used in the adhesion to Caco - 2. pUC57 - cmbA4 failed to transform in to both Lc. lactis and E. coli PK401. It was speculated that the si ze of the gene (3,4kb) might be too big for introduction in the cells. In addition, the gene has properties that make it difficult to introduce in different strains. Since the number of repetitive regions is what separates the genes it might be this partic ular extra part in cmbA4 which causes difficulties. DSM20016 and L. reuteri 6475 were u sed in the growth experiment to analyze the repetitive regions. Bile and mucin was used as media component to see if these affected the result. In this experiment the s trains with bile grew significantly slower tha n the other bacterial cultures, though the growth increased with addition of MOPS - buffer. MOPS might prevent inhibiting in the cultures with bile. DSM20016 and 6475 with mucin grew fastest. There were no signif icant differences in the repetitive regions in the patterns from PCR. However, in DSM20016 it might be that mucin induces greater variation and difference in binding, considering that mucin had higher yield in the end of the growth experiment than the cont rol (DSM20016 without mucin). 6475 had more bands than 6475 with bile and mucin, this could mean that mucin or bile inhibits the ability to greater variation in the repetitive regions.