Characterization of expansin-like proteins from the plant pathogen Zymoseptoria tritici

Abstract

Kravet om å øke matproduksjonen for en voksende menneskelig befolkning på en bærekraftig måte samtidig som man håndterer problemer som matavfall og fattigdom forblir en betydelig global utfordring. Klimaendringer har vist seg å ytterligere komplisere disse problemene. Et spesifikt eksempel på dette er at det har vist seg å føre til utvikling og spredning av plantesykdommer, som kan påvirke viktige avlinger, som hvete.

Den soppsykdomsfremkallende Zymoseptoria tritici, som tidligere var kjent som Mycosphaerella graminicola, utgjør en betydelig trussel mot hveteavlinger ved å vise verts spesifisitet og resistens mot soppmidler. Som et resultat har det kommet under nylig vitenskapelig granskning. En bedre forståelse av dynamikken til plantecellevegger er avgjørende for forsvaret mot slike patogener.

Expansiner, som er ikke-enzymatiske proteiner til stede i plantens cellevegg, er identifisert i sopp- og mikrobielle arter. Sopp- og mikrobeekspansiner har blitt funnet å delta i patogene og gjensidige mønstre. Plantecellevegg ekspansiner er ansvarlige for avslapning og løsning av celleveggen, noe som er en skadelig prosess for avlinger med tanke på at det kan påvirke ulike egenskaper ved planten. I denne avhandlingen ble fire ukarakteriserte expansin-like proteiner fra Z. tritici undersøkt for å avgjøre om de også har lignende evner til plantecellevegg expansiner.

I denne studien ble utvalgte polysakkaridsubstrater som cellulose, hemicellulose og andre som er til stede i plantecelleveggen, behandlet med ekspansin-lignende proteiner produsert på laboratoriet. Dette ble gjort for å avgjøre om de kan løsne polysakkaridene som er til stede i celleveggen gjennom protein-substratinteraksjon. Senere ble det undersøkt om de kunne kvantifiseres ved hjelp av HPAEC-PAD og MALDI-TOF. Optimalisering av ulike parametere som pH, temperatur og enzymkonsentrasjon og de ulike polysakkaridsubstratene som ble brukt, er viktige i karakteriseringen av expansin-lignende proteiner.

For å få en bedre forståelse av de modne proteinene, ble potensielle post-translasjoner modifikasjoner (PTMer) som N-glykosylering undersøkt ved hjelp av N-deglykosyleringsenzymet EfEndo18A.

I denne studien ble de fire ekspansin-lignende proteinene - F9, F11, F12 og F14 - dyrket og renset. Protein F9 ga de mest lovende resultatene med hensyn til N-deglykosylering. Protein F11 syntes å ha egenskaper som gjorde det utfordrende å rense, mens F14 viste seg å ha en molekylvekt nesten dobbelt så stor som forventet størrelse. Analyse av expansin-like proteiners effekt på polysakkaridsubstrater avslørte ingen distinkt aktivitet på substratene i den nåværende studien, men dette forblir en stor vei som fortsatt er i sin begynnelse og med potensiale til å bli brukt i ulike felt.

The demand to increase food production for a growing human population in a sustainable manner while handling issues such as food waste and poverty remains a significant global challenge. Climate change has shown to further complicate these issues. A specific example of this being that it has shown to lead to the development and spread of plant diseases, which can affect important crops, such as wheat.

The fungal pathogen Zymoseptoria tritici, which was previously known as Mycosphaerella graminicola, poses a significant threat to wheat crops by displaying host specificity and resistance to fungicides. As a result, it has come under recent scientific scrutiny. A better understanding of the plant cell walls dynamics is crucial for the defense against such pathogens.

Expansins, which are non-enzymatic proteins present in the plants cell wall, have been identified in fungi and microbial species. The fungi and microbe expansins have been found to engage in pathogenic and mutualistic patterns. Plant cell wall expansins are responsible for the relaxation and loosening of the cell wall, which is a detrimental process for crops considering it can affect different properties of the plant. In this thesis, four uncharacterized expansin-like proteins from Z. tritici were examined to determine if they also possess similar abilities to plant cell wall expansins.

In this study, select polysaccharide substrates such as celluloses, hemicelluloses and others that are present in the plant cell wall were treated with the expansin-like protein produced at the laboratory. This was done to determine if they can loosen the polysaccharides present in the cell wall through protein-substrate interaction. Later, it was examined whether they can be quantified by means of HPAEC-PAD and MALDI-TOF. Optimization of various parameters such as pH, temperature and enzyme concentration and the various polysaccharide substrates utilized are important in the characterization of the expansin-like proteins.

To get a better comprehension of the mature proteins, potential post-translation modifications (PTMs) such as N-glycosylation were investigated by employing the N-deglycosylation enzyme EfEndo18A.

In this study, the four expansin-like protein – F9, F11, F12 and F14 – were cultivated and purified. Protein F9 produced the most promising results in regard to N-deglycosylation. The F11 protein appeared to have properties that made it challenging to purify, while F14 was shown to have a molecular weight almost double the expected size. Analysis of the expansin-like proteins’ effect on polysaccharide substrates did not reveal any distinctive activity on the substrates in the current study, but this remains a large avenue that is still in its infancy and with the potential to be applied in various fields.