Investigating the inflammatory effect of mitochondrial DNA (mtDNA) during sepsis

Abstract

Sepsis er en livstruende tilstand som utgjør en global helsebyrde. Sepsis oppstår når kroppens immunsystem blir dysregulert, dette forårsaker multiorgansvikt som kan føre til død. Å oppdage sykdommen i tidlige stadier og rask starte behandling kan betydelig forbedre pasientresultater og øke sjansene for overlevelse. Effektive biomarkører er nødvendige for å oppdage sepsis tidlig. Forståelse av opprinnelsen og mekanismen til sepsis er avgjørende for å utvikle gode biomarkører.

Den sykliske GMP-AMP-syntasen (cGAS) spiller en kritisk rolle i vårt immunforsvar ved å identifisere cytosolisk DNA og igangsette en rekke hendelser. Når cytosolisk DNA binder seg til cGAS, utløser det syntesen av syklisk GMP-AMP (cGAMP), som er en sekundærmessenger som aktiverer stimulatoren av interferongener (STING) -veien. Denne signalveikaskaden er ikke bare essensiell for vårt forsvar mot virale og bakterielle infeksjoner, men den er også vital for å gjenkjenne unormalt selv-DNA. Dysreguleringen av cGAS-STING-veien har blitt knyttet til patogenesen av ulike autoimmune og inflammatoriske lidelser. Derfor har denne masteroppgaven som mål å bedre forstå cGAS-aktiveringsveien i utviklingen og progresjonen av sepsis og den potensielle involveringen av mitokondrielt DNA (mtDNA) og muligens andre nukleinsyrer, i extracellulære vesikler (EV) og plasma. Studien vurderte affiniteten mellom cGAS og ulike nukleinsyrer gjennom mikroskala termoforese (MST). For å estimere cGAS- aktivering på tvers av ulike grupper – sepsis-pasienter, pasienter med organsvikt og friske kontroller – ble produksjonen av cGAMP kvantifisert via enzymkoblet immunosorbentanalyse (ELISA). Videre, for å bestemme rollen til RNA i denne aktiveringsprosessen, ble pasientprøver behandlet med RNase før kvantifisering av cGAMP. Til slutt ble kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) brukt for å estimere nivåene av nukleært DNA (nDNA), mitokondrielt DNA (mtDNA) og mtDNA-skade i pasientprøvene.

Studien oppdaget noen uventede forskjeller mellom bindingen av cGAS og produksjonen av cGAMP, spesielt med hensyn til RNA-DNA-hybrider. Aktiveringen av cGAS var høyere i plasmaprøver enn i EV-prøver, og RNase påvirket cGAS-aktivering betydelig i begge prøvetypene. Videre viste kontrollgruppene av plasma høyere nivåer av cGAS-aktivering enn sepsis- og organsviktgruppene. Plasma inneholdt mer mtDNA, mens EV hadde en høyere forekomst av skadet mtDNA. Sammenlignet med kontroll gruppen viste plasma fra sepsis- og organsviktgruppene signifikant forhøyede nivåer av nDNA.

Sepsis is a life-threatening condition that is a worldwide health liability. Sepsis occurs when the body's immune system becomes dysregulated, causing multiple organ failure and potentially resulting in death. Detecting the disease in its early stages and receiving timely treatment can significantly improve patient outcomes and increase chances of survival. Thus, effective biomarkers are necessary to detect sepsis in its early stages. Understanding the origin and mechanism of sepsis is crucial for developing sufficient biomarkers.

The Cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) plays a critical role in our immune response by identifying cytosolic DNA and initiating a series of events. When cytosolic DNA binds to cGAS, it triggers the synthesis of cyclic GMP-AMP (cGAMP), which is a second messenger that activates the stimulator of interferon genes (STING) pathway. This signaling cascade is not only essential for our defense against viral and bacterial infections, but it is also vital for recognizing abnormal self-DNA. The dysregulation of the cGAS-STING pathway has been implicated in the pathogenesis of various autoimmune and inflammatory disorders. Therefore, this master project aims to better understand the cGAS activation pathway in the development and progression of sepsis, and the potential involvement of mitochondrial DNA (mtDNA) and possibly other nucleic acids, in extracellular vesicles (EVs) and plasma. The study assessed the affinity between cGAS and various nucleic acids through microscale thermophoresis (MST). To estimate cGAS activation across different cohorts—sepsis patients, organ failure patients, and healthy controls—the production of cGAMP was quantified via enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, to determine the role of RNA in this activation process, patient samples were pre-treated with RNase before cGAMP quantification. Finally, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was employed to estimate the levels of nuclear DNA (nDNA), mitochondrial DNA (mtDNA), and mtDNA damage in the patient samples.

The study discovered some unanticipated differences between the binding of cGAS and the production of cGAMP, particularly regarding RNA-DNA hybrids. The activation of cGAS was higher in plasma samples than in EV samples, with RNase significantly affecting cGAS activation in both sample types. Further, the control groups of plasma exhibited higher levels of cGAS-activation than the sepsis and organ failure groups. Furthermore, plasma contained more mtDNA, while EVs had a higher prevalence of damaged mtDNA. Compared to controls, plasma from the sepsis and organ failure groups had significantly elevated nDNA levels.