Exploiting tumour glycosylation for the personalised immunotherapy of breast cancer

Abstract

Til tross for en stadig større forståelse av kreft genomet, er det fortsatt et betydelig gap i forståelsen av de fullstendige egenskapene til kreft glykomer og glykoproteom. Glykaner spiller en avgjørende rolle i essensielle molekylære og cellulære prosesser som finner sted i kreft. Disse prosessene inkluderer cellesignalering, kommunikasjon, tumor angiogenese, immunmodulering og metastase dannelse. Glykaner regulerer progresjonen av kreft gjennom endringer i glykosylering og fungerer også som betydelige biomarkører og tilbyr spesifikke mål for terapeutisk anvendelser.

For dette prosjektet var det ønskelig å se nærmere på uttrykket av CLR-ligander på kreftcellelinje og kartlegge dem. I tillegg til å produsere CLR-CAR-NK celler og teste deres cytotoksiske aktivitet. Der egnede CLR-domener for tumormålretting og CAR-konstruksjon vil bli valgt basert på genererte data. Deretter transfekter dem inn i NK-celler og test deres cytotoksiske aktivitet mot ligandbærende kreftceller.

Tumorceller ble screenet for uttrykk av CLR-ligander. Ligandbindende domene til CLR ble fusjonert med det humane immunglobulin Fc-domenet, noe som tillot enkel deteksjon ved bruk av sekundære antistoffer. Fusjonsproteinene som ble produsert ble brukt til å farge tumorceller direkte ved bruk av flow cytometri. Tumorceller som uttrykker en ligand, vil binde seg til fusjonsproteinet og tillater påvisning av ligandekspresjon. Passende CLR-domener for tumormålretting og genere CAR-konstruksjoner ble valgt basert på resultatene av screeningen av CLR ligander.

Resultatene fra screening av CLR-ligandekspresjon på kreftcellelinjer var variable og ulike fra kjøring til kjøring, med noen likheter eller trender fra kjøring til kjøring. Noen hindringer oppsto ved ligering og transfeksjon av pUC19 og inserts ble utført. Dette førte til at få prøver ble sendt til sekvensering, som også endte opp med å ikke ha samsvarende sekvenser. Det var derfor ikke mulig å gå videre med prosjektet på grunn av tidsbegrensning.

Til slutt, så er enda flere FACS-kjøringer med fusjonsproteiner for hver cellelinje nødvendig. Noe som ville gi en bredere forståelse av uttrykket av CLR-ligander. Flere forsøk (og feil) er også avgjørende for å eliminere mulige feilkilder når det gjelder ligering og transfeksjon av CAR-konstruksjonene. Resultatene viste ikke at CLR-ene var spesifikke for hver cellelinje, og ingen CAR-konstruksjon ble produsert med suksess. Med mer tid og testing i stor skala, kan resultere i interessante funn.

Despite recent advances in undertanding the cancer genome, there is still a significant gap in understanding the complete characteristics of cancer’s glycome and glycoproteome. Glycans play a crucial role in essential molecular and cellular processes that take place in cancer. These processes include cell signalling and communication, tumour angiogenesis, immune modulation and metastasis formation. Changes in glycosylation regulate the genesis and progression of the disease and also serve as significant biomarkers and offer specific targets for therapeutic intervention.

For this project, we wanted to look further into the expression of CLR ligands on cancerous cell lines and categorise them, as well as to generate CLR-CAR-NK cells and test their cytotoxic activity. Suitable CLR domains for tumour targeting and CAR construct would be chosen based on generated data, and thereafter, transfected into NK cells to test their cytotoxic activity against ligand-bearing cancer cells.

Tumour cells were screened for expression of CLR ligands. Ligand-binding domain of the CLR was fused with the human immunoglobulin Fc-domain, allows simple detection using secondary antibodies. The fusion proteins produced was used to directly stain tumour cells using flow cytometry. Tumour cells expressing a ligand will bind to the fusion protein allowing detection of ligand expression. Suitable CLR domains for tumour targeting and generate CAR construct were chosen based on the screening for expression.

The results from screening CLR ligand expression on cancerous cell lines were variable and differed from run to run. Nevertheless, the results did show some similarities or trends from run to run. Some problems occurred when ligation or and transfection of pUC19 and inserts were done. Therefore, few samples were sent for sequencing, which also ended up not matching the given sequences. As a result, it was not possible to move further on with the project due to the time limit.

In conclusion, even more FACS runs with fusion proteins for each cell line are necessary. This would provide a broader understanding of the CLR ligands expression. More trials (and errors) are also essential to eliminate potential sources of error when it comes to ligation and transfection of the CAR constructs. Ultimately, the results did not show that the CLRs were specific for each cell line and no CAR construct were successfully produced. However, with more time and testing on a larger scale, it could result in interesting findings.