Deciphering ADA2 Deficiency: Creating an ADA2 deficiency model using CRISPR/Cas genome editing

Abstract

Mangel på adenosindeaminase 2 (DADA2) er en sjelden autoinflammatorisk lidelse forårsaket av bialleliske mutasjoner i adenosindeaminase 2 (ADA2) genet. Pasienter med DADA2 viser et bredt spekter av kliniske manifestasjoner, og tilstanden kan være livstruende. Sykdomsmekanismene til DADA2 er i stor grad ukjente og for å øke kunnskapen i dette feltet, hadde denne studien som mål å lage DADA2-cellemodeller og studere effekten av nedslått ADA2 genuttrykk på to sentrale immune celle mekanismer: proliferasjon av monocytter og makrofagpolarisering.

For å gen redigere ADA2 ble guide RNA (gRNA) og CRISPR-assosiert protein 9 (Cas9) introdusert inn i THP-1 celler ved bruk av elektroporering. De gen redigerte cellene ble videre sortert ved bruk av fluorescensaktivert cellesortering (FACS), hvor til slutt fire av de utvalgte klonene viste en homozygot delesjon i ADA2-genet som er forventet å forårsake en leseramme forskyvning i budbringer-RNA (mRNA).

En proliferasjon analyse som ble utført på ADA2-redigerte, ikke-sorterte celler ved bruk av Incucyte S3 viste at de redigerte cellene hadde en signifikant lavere proliferasjon sammenlignet med kontroll celler. Effekten av DADA2 på makrofagpolarisering ble testet på sorterte ADA2-redigerte celler og evaluert med spesifikke markører ved hjelp av kvantitativ PCR (qPCR). Cellene ble først differensiert til M0 og deretter polarisert til M1 og M2a makrofager. Resultatene indikerte at DADA2-cellemodeller viste en favorisert polarisering mot M1 makrofager. Eksperimentelle begrensninger oppsto, og ytterligere testing må gjøres for å trekke pålitelige konklusjoner.