How enzyme and substrate concentration influence the synergy effect on chitin degradation by SmChiA and SmAA10A

Abstract

Motstandsdyktige polysakkarider som cellulose og kitin er rikelig produsert av organismer i naturen, og nedbrytning av disse til produkter av verdi holder et stort potensial for bruk i en bærekraftig fremtid som innebærer utnyttelse av biomasse som tidligere var ansett som avfall. Kitin nedbrytende enzymer fra S. marcescens inneholder nøkkel-enzymene SmChiA og SmAA10A (tidligere kjent som CBP21). SmChiA er et exoaktivt prossessivt enzym som hydrolyserer glykosidbindinger fra den enden av kitin-kjeden, mens kobber-avhengige SmAA10A bryter opp krystallinsk kitin med endoaktiv oksidasjon som frigjør kjede ender til kitinasen. Disse komplementære aktivitetene har vist å gi synergi effekt når disse enzymene jobber sammen på kitin. Denne oppgaven har undersøkt hvordan endring i enzym konsentrasjon, substrat konsentrasjon, peroxygenase betingelser, og forbehandling av substrat med SmAA10A påvirker kitobiose utbytte.

Den største synergi effekten ble oppnådd ved høy β-kitin substratkonsentrasjon, relativt lav SmChiA konsentrasjon i 1:10 forhold med SmAA10A og stabilt lav H2O2 tilførsel som gir peroxygenase betingelser. Det samme kitobiose utbyttet kan bli anskaffet av en lavere mengde SmChiA hvis var SmAA10A var tilstede, men SmAA10A ga ingen synergi effekt ved lavere substrat konsentrasjoner. I tillegg ved minimal substrat konsentrasjon, påvirket SmAA10A negativt kitobiose oppløsning av SmChiA.

Det andre målet med oppgaven var å klone SmChiA inn i det industrielle ekspresjons systemet i P. Pastoris. Dette resulterte i aktivt enzym med liknende aktivitet sammenlignet med E. coli produsert SmChiA. Dette legger til rette for kloning av et kitinolytisk maskineri inn i P. pastoris som vil sekrere riktig foldet enzymer for enklere rensing og industriell anvendelse.

Recalcitrant polysaccharides like cellulose and chitin are profusely produced by organisms in Nature and degrading these for products of value show a large potential in industrial application of a sustainable future of utilizing biomass that previously was considered waste. Chitinolytic enzymes from S. marcescens include the key enzymes SmChiA and SmAA10A (previously known as CBP21). SmChiA is an exo-acting processive enzyme, which hydrolyze glycosidic bonds from the reduced end of the chitin chain, while the copper-dependent SmAA10A disrupts crystalline chitin by endo-acting oxidative cleavage releasing chain ends for the chitinase. These complimentary actions have been shown to result in synergy effects when these enzymes work together on chitin. This thesis has investigated how the change of enzyme, substrate concentrations, peroxygenase conditions, and pretreatment of the substrate with SmAA10 A influence the chitobiose yield.

The largest synergy effect was obtained at high β-chitin substrate concentrations, relatively low SmChiA concentration in a 1:10 ratio with SmAA10A and steady low H2O2 supply generating peroxygenase conditions. The same chitobiose yield can be obtained by a lower amount of SmChiA if SmAA10A was present, but SmAA10A gave no synergy effect at lower substrate concentrations. Also at minimal substrate concentrations, SmAA10A negatively influenced chitobiose solubilization by SmChiA.

The second aim was to clone SmChiA into the industrial expression system of P. pastoris. This resulted in an active enzyme with similar activity compared to E. coli produced SmChiA. This facilitates the cloning of a whole chitinolytic machinery into P. pastoris that will secrete properly folded enzymes for easier purification and industrial applications.