| dc.description.abstract | Streptococcus pneumoniae er et opportunistisk patogen som koloniseres i den øvre delen av respirasjonssystemet hos om lag 10% av verdens befolkning. Infeksjoner forårsaket av denne bakterien inkluderer mellomørebetennelse, bihulebetennelse og lungebetennelse, men den kan også forårsake mer alvorlige systemiske infeksjoner som bakteriemi og hjernehinnebetennelse. Dette patogenet er ansvarlig for omtrent 1 million dødsfall årlig på verdensbasis. Den vanligste måten å behandle S. pneumoniae infeksjoner på, er med β-lactam antibiotika (for eksempel penicillin). Den angriper såkalte penicillin-bindende proteiner (PBPer) som er ansvarlige for celleveggsyntesen. PBPer er enzymer som, gjennom transglykosylerings- og transpeptideringsreaksjoner, syntetiserer peptidoglykanlaget som omgir den cytoplasmiske membranen hos de fleste bakterier. Forløperen til celleveggen er et molekyl som kalles muropeptid. Den består av et disakkarid med et pentapeptid festet til seg. Peptiddelen kan enten være lineær eller forgreinet, hvilket betyr at den har to ekstra aminosyrer festet til seg. Celleveggen til pneumokokker består av både lineære og forgreinede muropeptider. β-laktamresistente isolater har ofte en forøkning i antall forgreinede muropeptider i celleveggen. Et protein som heter MurM er nødvendig for at det skal dannes forgreinede forløpere. Ved å slå ut murM i resistente stammer, blir de resensibilisert til penicillin, hvilket sterk indikerer at inkorporeringen av forgreinede muropeptider i peptidoglykanen er kritisk for penicillinresistens.
Hypotesen for denne studien er at en lavaffinitetsversjon av PBP2b enten foretrekker en forgreinet struktur på muropeptidene, eller så er den mindre aktiv, noe som fører til kompenserende celleveggsyntese av en av de andre tilgjengelige PBPene. Det at en PBP er lavaffinitet betyr at den har en lavere affinitet mot penicillin, og vil derfor binde mindre penicillin enn de som ikke er det (Chambers, 1999). For å studere dette ble det laget mutantstammer hvor pbp2b og klasse A PBPene (pbp1a, pbp1b og pbp2a) var slått ut hver for seg. Disse ble fenotypisk testet for å se om det var noen endringer i deres sammensetting av celleveggen. Stammene RSG77 og Pen6 ble valgt til å være den genetiske bakgrunnen i denne studien, fordi de er begge høyresistente stammer og de har et høyt antall forgreinede muropeptider i celleveggen. RSG77 er en stamme som er laget av MolMik gruppen. Mutantstammene ble avbildet ved mikroskopi for å se hvilke morfologiske endringer som skjedde når de ulike PBPene var slått ut. Basert på informasjonen som finnes om disse utslåingene fra før av, så hadde både ∆pbp2b og klasse A PBP mutantene en forventet morfologisk endring. ∆pbp2b stammene hadde en morfologi hvor cellene var kortere og vokste i kjeder, mens mutantene uten klasse A PBPene hadde lite endring fra den genetiske bakgrunnen. Sammensettingen av høyaffinitets-PBPene som var til stede i hver stamme ble visualisert med fluorescerende merking med bocillin på SDS-PAGE. Der hvor båndene ikke vises er enten PBPen slått ut eller så er det en lavaffinitets PBP istedenfor. En HPLC analyse av alle stammene ble gjennomført for å undersøke endringer i mengden forgreininger som var til stede i celleveggen. Resultatene fra HPLC viste ingen store endringer i celleveggen til klasse A PBPene. I de stammene hvor pbp2b var slått ut i RSG77, var det et lite skifte og mengden forgreininger var større når PBP2b var til stede. Disse endringene ble ikke observert for de samme mutantene i Pen6. | |
