Exploration of the plastic-binding potential of lytic polysaccharide monooxygenases

Abstract

Lytiske polysakkaridmonooksygenaser (LPMO-er) er enkelt-kopper enzymer som besitter en unik egenskap til å oksidere krystallinske overflater av motstandsdyktige polysakkarider som er utilgjengelige for konvensjonelle hydrolytiske enzymer. Den kraftfulle naturen til reaktive oksygenarter som dannes av LPMO-er, har fått noen forskere til å tro at disse enzymene kan være relevante for oksidativ nedbrytning av andre polymerer som er motstandsdyktige mot hydrolyse, inkludert plastmaterialer. Denne ideen er delvis basert på tanken om at den høye krystalliniteten og hydrofobiteten til materialer som polyetylen, til en viss grad, kan ligne overflateegenskapene til de naturlige substratene som LPMO-er fra før kan oksidere (for eksempel cellulose eller kitin). Denne avhandlingen hadde som mål å undersøke om den potensielle likheten mellom uløselige polysakkarider og plastmaterialer fører til at LPMO-er binder seg til polyetylen (PE), polyetylentereftalat (PET) og polypropylen (PP). For å svare på dette spørsmålet ble det utført screening-eksperimenter med LPMO-er fra ulike LPMO-familier, og flere screening-teknikker ble evaluert, inkludert konkurranseanalyser av binding med LPMO-er, cellulose og plastmaterialer av interesse. Resultatene som ble oppnådd i dette prosjektet indikerer at noen, men ikke alle, LPMO-er faktisk har en merkbar grad av binding til LDPE, HDPE og PP. Dette gjelder spesielt for CelS2 (også referert til som ScLPMO10C), en modellbakteriell LPMO som består av en katalytisk domene tilhørende familie 10 og en tilleggsfamilie 2 karbohydratbindingsmodul (CBM). Denne LPMO-en ble grundig undersøkt ved å sammenligne bindingen til plastmaterialer med bindingdataene som ble oppnådd med to konstruerte varianter av enzymet: CelS2TR, som mangler CBM, og CelS2-CBM1, som har en familie 1 karbohydratbindingsmodul i stedet for familie 2 CBM til den naturlige typen. CelS2-CBM1 ble designet og produsert som en del av dette prosjektet. Eksperimentene indikerte at det er CBM og ikke den katalytiske domenen til CelS2 som bidrar mest til den observerte bindingen til plastmaterialer. Viktigst er det at evnen til familie 2 CBM til å veilede LPMO-ens binding til plastmaterialer viste seg å være mye høyere enn familie 1 CBM. Derfor representerer karbohydratbindingsmodulen til den ville typen CelS2 et potensielt startpunkt for fremtidige proteiningeniørkampanjer med mål om å skape proteiner som sterkt kan binde seg til krystallinske hydrofobe polymerer, som for eksempel PE

Lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) are mono-copper enzymes that possess a unique ability to oxidize crystalline surfaces of recalcitrant polysaccharides that are inaccessible to canonical hydrolytic enzymes. The powerful nature of reactive oxygen species generated by LPMOs has led some researchers to believe that these enzymes may be relevant to oxidative degradation of other polymers resistant to hydrolysis, including plastics. This idea is partly based on the notion that the high crystallinity and hydrophobicity of materials such as polyethylene may to some extent resemble the surface properties of known LPMO substrates (e.g., cellulose or chitin). This thesis was aimed at investigating whether the potential similarity between insoluble polysaccharides and industry relevant plastics results in ability of LPMOs to bind polyethylene (PE), polyethylene terephthalate (PET) and polypropylene (PP). To address this question, screening experiments featuring a variety of LPMOs were performed, and multiple screening techniques were evaluated, including binding competition assays with LPMOs, cellulose and plastics of interest. The results obtained in this thesis project indicate that some but not all LPMOs indeed possess a noticeable degree of binding to LDPE, HDPE, and PP. This is particularly the case for CelS2 (also referred to as ScLPMO10C), a model bacterial LPMO comprising a family 10 catalytic domain and an auxiliary family 2 carbohydrate-binding module (CBM). This LPMO was studied in detail by comparing its binding to plastics to the binding data obtained with two engineered variants of the enzyme: CelS2TR, lacking CBM, and CelS2-CBM1, possessing a family 1 carbohydrate-binding module instead of the wild-type CBM. The later protein was designed and produced as the part of this project. The experiments indicated that it is the CBM and not the catalytic domain of CelS2 that contributes most to the observed binding to plastics. Importantly, the ability of family 2 CBM to guide the LPMO binding to plastics was shown to be much higher than of family 1 CBM. Therefore, the carbohydrate-binding module of the wild-type CelS2 represents a potential starting point for future protein engineering campaigns aimed at creating proteins that can strongly bind to crystalline hydrophobic polymers, such as PE.