Identifisering og karakterisering av bakteriocinet amylocyclicin fra Bacillus velezensis, og dets potensial mot Listeria monocytogenes

Abstract

Stadig flere bakterier blir resistente mot antibiotika som brukes for å behandle bakterielle infeksjoner. Verdens helseorganisasjon har erklært antimikrobiell resistens som et av verdens største globale helseutfordringer som menneskeheten står ovenfor. For å kunne løse problemet er det avgjørende å finne alternativer til dagens bruk av antibiotika. En del av løsningen kan være å benytte bakteriers egenproduserte antimikrobielle peptider, også kalt bakteriociner. Bakteriociner er små ribosomalt syntetiserte peptider med stor variasjon i både struktur, aktivitet og målorganismer. Bakteriociner produseres av en rekke ulike bakterier, og syntesen av bakteriociner krever som regel minst to ekstra gener som koder for dedikerte transport- og immunitetsproteiner. Immunitet gjør at produsenten ikke blir hemmet av sitt eget bakteriocin, og på den måten utnyttes bakteriociner i konkurranse om næring og nisjer.

Målet for denne oppgaven var å identifisere og karakterisere et antimikrobielt stoff produsert av en Bacillus velezensis stamme. Ved bruk av helgenomsekvensering, revers-fase kromatografi og massespektrometri ble dette stoffet identifisert til å være det sirkulære bakteriocinet amylocyclicin. Amylocyclicin var allerede beskrevet, men det var mye som ikke var kjent om peptidets antimikrobielle aktivitet, virkemåte og immunitet. Dette bakteriocinet ble derfor undersøkt videre.

Amylocyclicin viste seg å være et poredannende bakteriocin med høy stabilitet mot varme- og pH-forandringer, og hadde et bredt inhiberingsspekter mot nesten alle Gram-positive bakterier. Det ble observert spesielt god aktivitet mot den patogene bakterien Listeria monocytogenes, en robust bakterie som kan forårsake den alvorlige sykdommen listeriose. L. monocytogenes kan også danne biofilm, som er et problem i mat- og helseindustrien. Flere ulike matprodukter, som røkt laks, har tidligere vært smittekilde for denne bakterien. Amylocyclicin var effektiv mot biofilm produsert av L. monocytogenes, og konfokal mikroskopi viste at bakteriocinet reduserte både celletettheten og levende celler i biofilmen. I tillegg var amylocyclicin effektiv som preventiv behandling for å hemme vekst av L. monocytogenes inokulert på røkt laks.

Denne oppgaven viser at amylocyclicin har flere egenskaper som gjør at det kan være egnet for videre utvikling til bruk i mat- og helseindustrien. Videre forskning anbefales derfor på amylocyclicin og bakteriociner generelt, spesielt med hensyn til deres virkemåte og toksisitet, før de eventuelt kan utnyttes i kampen mot antibiotikaresistens.

An increasingly number of bacteria are becoming resistant to antibiotics commonly used to treat infections. The World Health Organization has declared antimicrobial resistance as one of the greatest public threats facing humanity. To solve this problem, it is crucial to find alternatives to how antibiotics are presently used. A part of the solution could be the use of the antimicrobial peptides produced by the bacteria themselves, molecules also known as bacteriocins. Bacteriocins are small ribosomally synthesized peptides that vary considerably in structures, activity, and target organisms. Bacteriocins are produced by many different bacteria, and their biosynthesis most often requires two extra genes encoding dedicated transport and immunity proteins. Immunity enables the producing organisms to inhibit other bacteria in competition for nutrients and niches.

The aim of this thesis was to identify and characterize an antimicrobial substance produced by a Bacillus velezensis strains. By the use of whole-genome sequencing, reversed-phase chromatography and mass spectrometry, the antimicrobial substance was identified as the circular bacteriocin amylocyclicin. Amylocyclicin have been previously described, but little is known about its antimicrobial activity, mode of action, and immunity.

Amylocyclicin was shown to have a mode of action involving pore-formation and to have high thermal and pH-stability. Additionally, amylocyclicin exhibited broad-spectrum activity towards most Gram-positive bacteria. The activity was particularly potent against Listeria monocytogenes, a robust pathogen that causes the serious illness listeriosis. L. monocytogenes is also a strong biofilm producer, which is a problem in the food and health industry. Several ready-to-eat food products, such as smoked salmon, have been the source of numerous listeriosis outbreaks. Amylocyclicin was effective at disrupting biofilms produced by L. monocytogenes, and confocal microscopy revealed that the amylocyclicin treatment reduced the cell density and living cells in the biofilm. Additionally, pre-treatment of smoked salmon with amylocyclicin was shown to effectively inhibit the growth of L. monocytogenes.

This thesis demonstrates that amylocyclicin has potential for applied use in the food and health industry. Further research on amylocyclicin and bacteriocins in general is thus needed, particularly regarding their mode of action and toxicity, prior to their effective use as a supplement or alternative to antibiotics.