Strukturelle og spektroskopiske studier av Tyrosinase fra Bacillus megaterium

Abstract

Prosjektet COOFIX har som formål å utvikle enzymer som fikserer og transformerer karbondioksid til flerkarbonforbindelser, enten som en enkeltstående bestanddel i industrielle prosesser eller som et ledd i allerede eksisterende biosyntetiske veier. Denne oppgaven tok for seg en av de mulige kandidatene involvert i COOFIX-prosjektet, og så på flere av effektene knyttet opp til en aminosyresubstitusjon i det aktive setet i et binukleært type-3 kobbersenter, funnet i en tyrosinase fra Bacillus megaterium (TyrBm 3NM8). I tillegg til avstanden mellom de to kobberatomene i det aktive setet, ble mutanten og villtypen undersøkt for deres evne til å binde nikkel framfor kobber, og binding av nitritt som en etterligner av aktivert karbondioksid, hovedsaklig gjennom røntgen-krystallografi. En generell karakterisering av den magnetiske og elektroniske signaturen til mutanten og villtypen ble også utført.

Krystallisering, røntgen-diffraksjon og modellbygging av de ulike variantene viste seg mer eller mindre vellykket, basert på observasjoner og statistikk hentet fra datainnsamlingen og modellraffineringen. Et unntak var å finne i variantene mettet med nitritt, hvor tall fra datainnsamlingen viste seg utilstrekkelig for videre prosessering. Fra de resterende modellene ble det observert en tydelig effekt på kobberavstanden i den muterte varianten, da den reduserte tilstanden viste en økning på 0.7 Å, og gode indikasjoner på binding av nikkel, både i villtypen og mutanten.

Effekten av mutasjonen var også observerbar i resultatene fra de spektroskopiske forsøkene, men i et begrenset omfang da disse ble utført under betingelser som ikke hentet frem det fulle potensialet til instrumentene som ble tatt i bruk. En UV-vis absorpsjonstopp rundt 350 nm for villtypen og 500 nm for mutanten viste seg karakteristisk for kompleksene med sentralatomet i en oksidert, toverdig tilstand. EPR-målingene ble utført i fravær av reduserende stoffer i løsningene, noe som førte til at de oksygen-aktiverte tilstandene ikke ble fanget opp. Mutasjonen var likevel synlig, gjennom de simulerte- og de eksperimentelle spektrene, og indikerte en noe lavere gz-verdi i mutanten enn i villtypen.

The COOFIX-project aims to develop enzymes that are able to fixate and transform carbon dioxide to multicarbon compunds, either as ”stand-alone” components in industrial processes or as part of already existing biosynthetic pathways. This thesis looked at one of several enzyme-candidates involved in the COOFIX-project, specifically at the effects permeating from a single amino acid substitution in a binuclear type-3 copper centre, found in a tyrosinase from Bacillus megaterium (TyrBm 3NM8). The distance between the two copper atoms in wildtype- and mutant-variants, as well as their ability to bind nickel instead of copper, and to coordinate nitrite as a molecular mimic of activated carbon dioxide, was investigated through X-ray crystallography. A general characterization of their electronic- and magnetic signature, through UV-vis and EPR-spectroscopy, was also included.

Observations and statistics from the crystallization, X-ray diffraction and modelbuilding, indicated promising results, with the exception of variants saturated with nitrite, which on the basis of statistics from the datacollection, was excluded. From the remaining models, a significant effect on the distance between the two copper atoms was observed, showing a 0.7 Å increase in the reduced mutant variant, as well as good indications on the binding of nickel in the active sites of both wildtype and mutant.

Effects of the mutation was also observed in spectroscopic data - both from UV-vis and EPR, although in a limited scope compared to the potential that lies in the instruments used. A UV-vis absorption around 350 nm for the wildtype and 500 nm for the mutant, characterized the oxidized state of the copper-complexes. The EPR-measurements was limited by the absence of reducing agents in the copper-saturated protein solutions, resulting in the oxygen-activated states not being recorded. The mutation was visible, through simulated and experimental spectra, indicating a somewhat lower value of gz in the mutant than in the wildtype.