Characterization of a Glycoside hydrolase family 50 member PaGH50A from Pseudomonas aeruginosa and exploring the enzyme’s potential in modulating biofilm formation

Abstract

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic human pathogen that causes acute and chronic lung infections in individuals with compromised immune systems. The bacterium is wide spread in the environment and especially persistent in clinical settings due to its ability to produce complex biofilms which contributes to its virulence. An important constituent of some P. aeruginosa biofilm variants is an exopolysaccharide called PsI. This exopolysaccharide consists of glucose, mannose and rhamnose moieties coupled by α/β-1,3-glycosidic linkages and is regularly branched with mannose attached by α-1,2 linkage. The main objective of this thesis was to provide a biochemical characterization of a putatively secreted family 50 glycoside hydrolase found in P. aeruginosa PA14. The enzyme which was named PaGH50A had previously been shown to have endo-1,3-β-glucanase activity and it was therefore of great interest to investigate its possible activity towards Psl. The secondary aim was to investigate the effect of PaGH50A on biofilms of P. aeruginosa strains PAO1 and its mutants PAO1 ∆WspF, PAO1 ∆WspF ∆Psl and PAO1 ∆WspF ∆Pel, all biofilm overproducers. The gene encoding PaGH50A, called PA14_50830 was cloned into a pNIC-CH vector, containing a hexa-histidine tag for convenient purification, that was subsequently transformed into E.coli strain BL21 for protein expression. Expression of enzymatically active protein was successful, and the protein yield obtained after incubation in a shaker incubator was 0.663 mg pure protein/ L and 0.945 mg pure protein/L after cultivation in a Lex-48 bioreactor. Enzyme activity assays showed that PaGH50A could hydrolyze curdlan, lichenan and most interestingly the psl exopolysaccharide which had not been shown before. Analysis of degradation products by MALDI-TOF MS showed that PaGH50A generated long chain oligomers. PaGH50A was shown to influence the biofilm development of P. aeruginosa PAO1 wild type and mutant variants and the effect depended on the when the enzyme was added during the biofilm formation process. The reasons and the mechanism for this phenomenon are unknown, however it can be hypothesized that the presence of PaGH50A leads to up or down regulations of genes involved in biofilm formation. This study represents a step forward in the understanding of PaGH50A, however the biological role of PaGH50A in P. aeruginosa biofilms remains unknown. Therefore, further proteomics analysis and employing mutant variants of PaGH50A must be done in order to further the knowledge of PaGH50A and the biofilm formation process.

Pseudomonas aeruginosa er et opportunistisk humant patogen som forårsaker akutte og kroniske lungeinfeksjoner hos personer med nedsatt immunsystem. Bakterien er vidt spredt i miljøet og er spesielt persistent i kliniske omgivelser på grunn av dens evne til å danne komplekse biofilmer som bidrar til dens virulens. En viktig bestanddel av noen P. aeruginosa biofilmvarianter er et eksopolysakkarid kalt Psl. Dette eksopolysakkaridet består av glukose-, mannose- og rhamnose koblet via α/β-1,3- glykosidbindinger og er regelmessig forgrenet med mannose koblet via α-1,2-kobling. Hovedmålet med denne oppgaven var å gi en biokjemisk karakterisering av et utskilt familie 50 glykosidhydrolase funnet i P. aeruginosa PA14. Enzymet som ble kalt PaGH50A har tidligere blitt vist seg å ha endo-1,3-β-glukanase aktivitet og det var derfor av stor interesse å undersøke dets mulige aktivitet mot Psl. Det sekundære målet var å undersøke effekten av PaGH50A på biofilmer produsert av P. aeruginosa-stammer PAO1 og mutanter PAO1 ∆WspF, PAO1 ∆WspF ∆Psl og PAO1 ∆WspF ∆Pel, alle biofilmoverprodusenter. Genet som koder for PaGH50A, kalt PA14_50830, ble klonet inn i en pNIC-CH-vektor, som ble transformert inn i E.coli-stammen BL21 for proteinekspresjon. Ekspresjon av enzymatisk aktivt protein var vellykket, og proteinutbyttet etter inkubering i en shakerinkubator var 0,663 mg rent protein/L og 0,945 mg rent protein/L etter dyrking i en Lex-48 bioreaktor. Enzymaktivitetsanalyser viste at PaGH50A kunne hydrolysere kurdlan, lichenan og mest interessant psl-eksopolysakkaridet som ikke er vist tidligere. Analyse av nedbrytningsprodukter av MALDI-TOF MS viste at PaGH50A genererte langkjedede oligomerer. PaGH50A ble vist å påvirke biofilmutviklingen av P. aeruginosa PAO1 villtype- og mutantvarianter, og effekten var avhengig av når enzymet ble tilsatt under biofilmdannelsesprosessen. Årsakene og mekanismen for dette fenomenet er ukjent, men det kan antas at tilstedeværelsen av PaGH50A fører til opp- eller nedreguleringer av gener involvert i biofilmdannelse. Denne studien representerer et skritt fremover i forståelsen av PaGH50A, men den biologiske rollen til PaGH50A i P. aeruginosa biofilmer er fortsatt ukjent. Derfor må ytterligere proteomikkanalyse og bruk av mutant varianter av PaGH50A gjøres for å fremme videre forståelse av PaGH50A og biofilmdannelsesprosessen.