Whole genome sequencing of HPV58 : specific primer design and performance

Abstract

Background: Human papillomavirus is a diverse group of viruses and the main cause for cervical cancer worldwide, contributing to 570 000 new cases each year. More than 200 HPV types are identified of which 14 of them are associated with cervical cancer. Next generation sequencing has made a revolutionary impact in molecular biology giving the opportunity to perform high-resolution comprehensive genome sequencing. Since the introduction, HPV research evolved from a simple presence or absence detection to a more comprehensive analysis of HPV genomics. However, most of the studies focus on HPV16 and 18 which contribute to 70 % of cervical cancer cases and less is known about the biology, pathogenesis and diagnostics of HPV58 infections. Aim: The main aim for this study was to design and test primers for HPV58 whole genome sequencing (WGS) with the TaME-seq protocol. Materials and methods: 50 HPV58 liquid-based cytology (LBC) samples from different diagnostic categories were included in this study. Specific primers were designed for HPV58 WGS using TaME-seq. The laboratory workflow included sample preparation, tagmentation, PCR amplification, sample pooling, size selection and final clean-up before sequencing. Finally, statistical analyses to study differences and correlations between sequencing data and samples were performed. Results: 68 overlapping HPV58 specific primers were designed. 109 million raw reads were generated of which 25 million mapped to HPV, mainly (96%) to HPV58. 12/50 samples did not pass the mean coverage threshold of 300x. Coverage profiles of the remaining 38 samples showed an overall good WGS coverage. Moreover, we did not find any correlation between the initial DNA concentration of samples and overall mean coverage. Mean coverage was not statistically different between samples in different diagnostic categories, nor between samples that were submitted to different size selections. And finally, the difference in mean number of off-target HPV mapping reads was significantly different between samples with single HPV58 infection and samples with multiple HPV infection including HPV58. However, the difference in mean coverage between these sample groups was not significantly different. Conclusions: Primer design for WGS of HPV58 using the TaME-seq approach has been successful. The established protocol has been shown robust for all diagnostic categories analyzed producing high quality HPV58 WGS data.

Bakgrunn: Humant papillomavirus er en mangfoldig gruppe virus og hovedårsaken til livmorhalskreft over hele verden som bidrar til 570 000 nye tilfeller hvert år. Mer enn 200 HPV-typer er identifisert, hvorav 14 av dem er assosiert med livmorhalskreft. Neste generasjons sekvensering (NGS) var et revolusjonerende bidrag innen molekylærbiologien, og åpnet muligheter for omfattende genom sekvensering. Siden introduksjonen av NGS, har forskning på HPV utviklet seg fra enkle deteksjonsanalyser til mer omfattende analyser av hele HPV genomet. Hovedfokuset har vært rettet mot HPV16 og 18 som bidrar til 70% av livmorhalskreft tilfeller, mens biologien, patogenesen og diagnostikken for HPV58- infeksjoner er mindre kjent. Formål: Hovedmålet med denne studien var å teste primere for HPV58 helgenom-sekvensering med TaME-seq protokollen. Materialer og metoder: 50 væske-baserte cytologi prøver i ulike diagnostiske grupper ble inkludert i denne studien. Det ble designet HPV58 spesifikke primere for sekvensering med TaME-seq protokollen. Arbeidsflyten innebar prøvebehandling, tagmentering, PCR-amplifikasjon, prøvesammenslåing, optimalisering av fragmentlengde og opprensing. Til slutt ble det utført statistiske analyser for å studere forskjeller og korrelasjon mellom sekvenseringsdata og prøver. Resultater: 68 overlappende HPV58-spesifikke primere ble designet. 109 millioner rå sekvenser ble generert, der 25 millioner var av HPV-opphav, i all hovedsak HPV58 (96%). 12/50 prøver oppnådde ikke gjennomsnittlig dekningsgrad med 300x. Dekningsgrad i resterende 38/50 prøver viste en generelt god dekning av hele HPV58-genomet. Videre ble det ikke funnet korrelasjon mellom DNA-konsentrasjonen i prøvene og gjennomsnittlige dekningsgraden. Det ble ikke funnet forskjell i den gjennomsnittlige dekningsgraden mellom prøver i ulike diagnostiske grupper, heller ikke mellom prøver med ulik gjennomsnittslengde på fragmenter. Signifikant forskjell i gjennomsnittlig dekningsgrad ble heller ikke funnet i sammenlikning av prøver infisert med HPV58 alene og de der HPV58 forekom sammen med andre HPV typer, men en signifikant høyere andel av totalt sekvenserte fragmenter var HPV58-spesifikke i prøver med infeksjon av HPV58 alene enn de med flere. Konklusjon: Primer design for helgenom-sekvensering med HPV58 ved bruk av TaME-seq-tilnærmingen har vært vellykket. Den etablerte protokollen har vise seg å være robust for alle diagnostiske kategorier som er analysert og produserer høykvalitets HPV58 helgenomsekvensdata.