Pharmacological tools to study transcriptional addictions in cancer

Abstract

Unfortunately, genetic diseases such as cancer are becoming more common among the global popu-lation, and only in 2020 approximately 19 million new cases were discovered, and 10 million lives were lost. With median overall survival of just over one year after diagnosis and with 1.6 % of all fatalities in 2020, brain and nervous system cancer represent one of the deadliest forms of this dis-eases. Moreover, 80 % of the malignancies occurring in the central nervous system are caused by gliomas, a type of tumour that originates from glial cells. Glioblastoma Multiforme (GBM) accounts for the most advanced and severe form of this cancer, with less than 5-10 % of people surviving longer than five years after diagnosis.

Foregoing studies indicate that genomic alternations leading to constitutive activation of CDK´s are a common factor for many cancer forms, including gliomas. For instance, brain cancer malignancies proliferate through the recruitment of several CDK´s early in G1 phase, and genomic instability in gliomas appears to be related to disturbances in S phase and in the transition between G2 and M phase. For this reason, numerous synthetically created CDK Inhibitors (CKI´s) have been studied in relation to cancer, with some of them making their way to the clinics. However, pre-clinical and clinical trials have generated mixed results over the past decades, giving a non-definite conclusion regarding the effectiveness of these therapeutics, especially on brain cancer.

In order to further elucidate the underlaying mechanisms that stimulate the aggressiveness of GBM in higher eukaryotes, different type of pharmacological tools targeting both transcriptional and cell cycle related CDK´s as well as drugs targeting ATR protein, human topoisomerase I and II and NF-κB activator were tested on two patient derived glioma cell lines (G7 and G144) and one control cell line (HeLa). Molecular techniques including cell viability assays and colony formation assays to-gether with Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) were applied for this purpose.

The results depict that inhibition of cell cycle related CDK 1 and 2 by AUZ454, CR-8, NVP-2 and RO-3306 as well as inhibition of ATR protein, human topoisomerase I and II and NF-κB activator, did similarly affect proliferation of both HeLa and G-cells, with no statistically significant differ-ences in neither colony formation nor cell viability assays. Likewise, targeting the transcriptional CDK´s 7 and 9 with LDC4297 and PROTAC CDK 9 Degrader-1, respectively, did not show any sta-tistical difference. However, FACS analysis on G144 with the latter mentioned compounds resulted in cell cycle arrest at G2/M and G1 phase, respectively, enlightening the role of transcriptional CDK´s on the cell cycle. Similarly, results originating from the colony formation assay after inhibi-tion of the transcriptional CDK´s 12 and 13 by THZ531 and SR-4835 did show a clear visual differ-ence on the proliferation between the control cell line and G-cells. In addition, FACS analysis on G144 with SR-4835 did result in cell cycle arrest at M/G1 phase, once again elucidating the effect of transcriptional inhibitors on the cell cycle. Degradation of CDK 12 by BSJ-4-116 gave no statistically significant results.

Genetiske sykdommer som kreft blir stadig mer vanlige blant den globale befolkningen, og bare i 2020 ble omtrent 19 millioner nye tilfeller oppdaget, og 10 millioner liv gikk tapt. Med median total overlevelse på litt over ett år etter diagnose og med 1,6 % av alle dødsfall i 2020, representerer hjer-nekreft en av de dødeligste formene for denne sykdommen. Dessuten, 80 % av malignitetene som oppstår i sentralnervesystemet forårsaket av gliomer, en type svulst som stammer fra gliaceller. Glioblastom (GBM) står for den mest avanserte og alvorlige formen av denne kreftformen, med mindre enn 5-10 % av menneskene som overlever lenger enn fem år etter diagnosen. Foregående studier indikerer at genomiske endringer som fører til konstitutiv aktivering av CDK-er er en vanlig faktor for mange kreftformer, inkludert gliomer. Maligniteter i hjernekreft prolifererer gjennom rekruttering av flere CDK-er tidlig i G1-fasen, og genomisk ustabilitet i gliomer ser ut til å være relatert til forstyrrelser i S-fasen og i overgangen mellom G2- og M-fasen. Av denne grunn har en rekke syntetiske CDK-hemmere (CDKI-er) blitt studert i sammenheng med kreftutvikling, med noen av dem som har allerede blitt implementert i behandlingsprogrammer verden rundt. Derimot, prekliniske og kliniske studier har generert blandede resultater de siste tiårene, noe som gir en ikke-klar konklusjon angående effektiviteten av disse medikamentene, spesielt ved behandling av hjerne-kreft. For å ytterligere belyse de underliggende mekanismene som stimulerer aggressiviteten til GBM i høyere eukaryoter, forskjellige typer farmakologiske verktøy rettet mot både transkripsjonelle og cellesyklusrelaterte CDK-er samt inhibitorer rettet mot ATR-protein, human topoisomerase I og II og NF-κB aktivator ble testet på to pasientavledede gliomcellelinjer (G7 og G144) og en kontrollcellelin-je (HeLa). Molekylære teknikker inkludert cellelevedyktighetsanalyser og kolonidannelsesanalyser sammen med fluorescensaktivert cellesortering (FACS) ble brukt for dette formålet. Resultatene viser at inhibering av cellesyklusrelatert CDK 1 og 2 av AUZ454, CR-8, NVP-2 og RO-3306 samt hemming av ATR-protein, human topoisomerase I og II og NF-KB-aktivator, påvirket proliferasjonen av både HeLa- og G-celler på samme vis, uten statistisk signifikante forskjeller i ver-ken kolonidannelse eller cellelevedyktighetsanalyser. Likeledes, inhibering av transkripsjonelle CDK-er 7 og 9 med henholdsvis LDC4297 og PROTAC CDK 9 Degrader-1, viste heller ingen statistisk forskjell. Derimot, FACS-analyse på G144 med de sistnevnte forbindelsene resulterte i cellesykluss-tans ved henholdsvis G2/M og G1-fasen, noe som opplyser rollen til transkripsjonelle CDK-er på cellesyklusen. Likeledes, resultater fra kolonidannelsesanalysen etter inhibering av de transkripsjon-elle CDK-ene 12 og 13 ved hjelp av THZ531 og SR-4835 viste en klar visuell forskjell på prolifera-sjonen mellom kontrollcellelinjen og G-celler. I tillegg resulterte FACS-analyse på G144 med SR-4835 i cellesyklusstans ved M/G1-fase, noe som igjen belyste effekten av transkripsjonshemmere på cellesyklusen. Nedbrytning av CDK 12 ved hjelp av BSJ-4-116 ga ingen statistisk signifikante resul-tater.