The impact of a structurally conserved second sphere residue in lytic polysaccharide monooxygenase catalysis

Abstract

Lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) are redox enzymes that enhance the degradation of recalcitrant polysaccharides available in biomass. Understanding the catalytic mechanism of LPMOs is of supreme importance in achieving the full potential of LPMOs in biomass conversion into valuable products. However, limited research covers the roles of individual amino acids involved in LPMO catalysis. This master’s thesis work provides insight of the impact of the gatekeeper residue on LPMO catalysis, as the gatekeeper residue is structurally conserved in all LPMOs families. The gatekeeper residue in AfAA11B (E160) and NcAA9C (Q180) was mutated to Glu, Gln, Asp, or Asn to observe the catalytic effect of changing the length and charge of the gatekeeper residue functional group. A gatekeeper residue of carboxylic acid nature introduced a negative charge near the copper center, whereas an amide gatekeeper residue was neutrally charged. The impact of the distance between the copper center and the gatekeeper functional group was assessed when the gatekeeper residue was either Glu or Asp, or Gln or Asn. Altering the length and charge of the gatekeeper side-chain were demonstrated to have a clear impact on several essential features for LPMO catalytic activity. AfAA11B and NcAA9C with a gatekeeper residue with relatively long side-chain of negative charge were identified with low redox potential of the copper site with low peroxidase activity and high oxidase activity. This high oxidase activity was associated with high catalytic activity of substrate oxidation in the presence of O2 and an external reductant during turnover. Substrate turnover with H2O2 supply was most efficient for the AfAA11B with a gatekeeper residue containing a long carboxylic acid functional group in the side chain. Furthermore, altering the electronic properties of the NcAA9C copper center also affected the transportation of radicals generated in the active site from the reaction between NcAA9C-Cu(I) and H2O2 in the absence of a substrate. As such, our results suggest two different routes through the LPMO to transport the oxidative holes. This study demonstrates the importance of the gatekeeper residue in two different LPMO families (AA9 and AA11) with different substrate specificity (cellulose and chitin). The gatekeeper residue appears essential in critical LPMO features such as electronic properties of the copper center, oxidase activity, peroxidase activity, and substrate turnover. Conclusively, this study provides a basis for future studies on the LPMO catalytic mechanisms of recalcitrant polysaccharide degradation.

Lytisk polysakkarid monooksygenaser (LPMOer) er redoksenzymer som bidrar til nedbrytning av vanskelig nedbrytbare karbohydrater tilgjengelig i biomasse. Forståelse av den katalytiske mekanismen til LPMOer er essensiell for å oppnå LPMOers fulle potensial i nedbrytningen av biomasse til verdifulle produkter. Likevel er det begrenset forskning som dekker rollene til individuelle aminosyrer involvert i LPMO katalyse. Denne masteroppgaven gir innsikt i «gatekeeper» residuens påvirkning av LPMO katalyse, fordi «gatekeeperen» er konservert i alle LPMO familier. «Gatekeeperen» i AfAA11B (E160) og NcAA9C (Q180) ble mutert til Glu, Gln, Asp eller Asn for å observere den katalytiske effekten av å endre lengden og ladningen til den funksjonelle gruppen i «gatekeeperen». En «gatekeeper» med en karboksylsyre som funksjonell gruppe i sidekjeden introduserte en negativ ladning nær koppersenteret, imens et amid «gatekeeper» residue var nøytralt ladet. Effekten av avstanden mellom koppersenteret og «gatekeeperens» funksjonelle gruppe ble analysert ved å mutere «gatekeeperen» til enten Glu eller Asp, eller Gln eller Asn. Variasjon av lengde og ladning på «gatekeeperens» sidekjede ble vist å påvirke flere essensielle egenskaper avgjørende for LPMO katalytisk aktivitet. AfAA11B og NcAA9C med en «gatekeeper» med en relativt lang, negativt ladet sidekjede ble identifisert med lave redokspotensialer for koppersetet med påfølgende lav peroksidaseaktivitet og høy oksidaseaktivitet. Denne høye oksidaseaktiviteten ble assosiert med høy katalytisk aktivitet ved substratoksidasjon hvor O2 og en ekstern reduktant var til stede. Substratomsetning med tilførsel av H2O2 var mest effektiv for LPMOen med en «gatekeeper» med en lang, karboksylsyre funksjonell gruppe i sidekjeden. Videre påvirket også variasjonen i koppersenterets elektroniske egenskaper for NcAA9C transporten av radikaler generert ved reaksjonen mellom LPMO-Cu(I) og H2O2 i fravær av substrat. Våre resultater antyder at det finnes to ulike transportruter for de frie radikalene gjennom LPMOer. Denne studien demonstrerer viktigheten til «gatekeeperen» i to ulike LPMO familier (AA9 og AA11) med ulik substratspesifisitet (cellulose og kitin). «Gatekeeperen» virker essensiell for viktige egenskaper til LPMOen, slik som elektroniske egenskaper til koppersenteret, oksidaseaktivitet, peroksidaseaktivitet, og substratomsetning. Denne studien gir et grunnlag for videre forskning av LPMOers katalytiske mekanisme for nedbrytning av vanskelige nedbrytbare karbohydrater.