Development of a CRISPR/Cas9 editing system for antigen knock-in in Lactiplantibacillus plantarum WCFS1

Abstract

Lactic acid bacteria (LAB) have been used in food products for hundreds of years and are commonly used in food fermentation, therapeutics, and for health promotion. They are “Generally Recognized as Safe”, have excellent stress tolerance to harsh environments and have proven to provoke the innate and adaptive immune system. These traits make LAB promising candidates as adjuvants and vectors for antigen delivery at mucosal sites. Considering the significant potential LAB holds in the industrial and medical field, the CRISRP/Cas9 tool should be implemented for use in LAB to facilitate scarless genetic manipulation. Since its discovery in 1987, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR) loci and their associated Cas9 endonucleases have transitioned from a prokaryotic immune system to a revolutionary tool for genome editing in eukaryotes. However, due to challenges and lack of methods, the state-of-art CRISPR/Cas9 has limited use in bacteria today. This study will try to solve some of the challenges encountered in CRISPR/Cas9 genome editing in bacteria and aims to develop a CRISPR/Cas9 knock-in system for use in Lactiplantibacillus plantarum WCFS1. The ultimate goal is to anchor the receptor binding domain (RBD) of SARS-CoV-2 to the cell surface of L. plantarum WCFS1, as a prototype for a SARS-CoV-2 mucosal vaccine. As a proof-of-concept, the goal was to insert the RBD fragment into the genome of L. plantarum WCFS1. Four necessary components for establishing CRISPR/Cas9 knock-in in bacteria; sgRNA, SpCas9, a donor repair template and a recombinase machinery, were assembled on a twoplasmid system. The CRISPR/Cas9 knock-in system I successfully inserted RBD into the genome of L. plantarum WCFS1. Optimalization of the knock-in system was attempted to increase efficiency and insert larger fragments (>800 bp). Yet, the CRISPR/Cas9 knock-in system referred to as system II, failed to yield knock-ins. The production of cytoplasmatic antigen from the L. plantarum WCFS1 knock-in strain of RBD was confirmed by Western blot. To compare genomic and plasmid-based cytoplasmatic production of RBD a pSIP vector was constructed. Characterization of the genomic, inducible expression of RBD indicates low production of RBD compared to the plasmid.

Melkesyrebakterier har blitt brukt i matprodukter i flere hundre år og blir anvendt i matfermentering og terapeutiske midler med helsefremmende effekter. De er generelt ansett som trygge, har utmerket stresstoleranse i ulike miljøer og kan stimulere det medfødte og adaptive immunforsvaret. Slike egenskaper gjør melkesyrebakterier til lovende kandidater som adjuvanter og vektorer for levering av antigener til slimhinner. Med tanke på potensialet til melkesyrebakterier innenfor industri og medisin, burde CRISPR/Cas9 verktøyet bli implementert i melkesyrebakteriefamilien for å muliggjøre genetisk manipulasjon uten avtrykk. Siden oppdagelsen av clustered regularly interspaced palindromic repeat (CRISPR) i 1987, har deres lokus og assosierte Cas9 endonukleaser gått fra å være et immunsystem i prokaryote organismer, til et revolusjonerende system for genmodifisering av eukaryoter. Likevel har mangel på metoder og andre hindringer ført til at CRISPR/Cas9 har begrenset bruk i bakterier i dag. Målet med denne studien er å løse noen av utfordringene til CRISPR/Cas9 genmodifisering i bakterier, samt å utvikle et CRISPR/Cas9 knock-in system for bruk i Lactiplantibacillus plantarum WCFS1. Hovedmålet er å ankre det reseptor bindende domenet (RBD) til SARSCoV-2 i cellemembranen til L. plantarum WCFS1 som en prototype for en SARS-CoV-2 slimhinnevaksine. For å bevise CRISPR/Cas9 mediert genomeditering, var målet å sette inn RBD fragmentet i genomet til L. plantarum WCFS1. Fire nødvendige komponenter for å etablere CRISPR/Cas9 knock-in i bakterier ble satt sammen i et to-plasmid-system: sgRNA, SpCas9, et donor reparerings templat og et rekombinase maskineri. CRISPR/Cas9 knock-in system I førte til vellykket innsetting av RBD i genomet til L. plantarum WCFS1. For å øke effektiviteten og sette inn større fragmenter (>800 bp), ble det forsøkt å optimalisere system I. CRISPR/Cas9 system II klarte ikke å skape noen knock-in. Produksjonen av cytoplasmatisk antigen fra L. plantarum WCFS1 knock-in stammen med RBD ble bekreftet med Western blot. En pSIP vektor ble konstruert for å sammenlikne genomisk og plasmidbasert cytoplasmatisk produksjon av RBD. Karakterisering av induserbar genomisk uttrykk av RBD, indikerer lav produksjon av RBD sammenliknet med plasmidproduksjonen