Funksjonelle studier av SmdA : et nytt protein involvert i celledeling og varmetoleranse i Staphylococcus aureus

Abstract

Staphylococcus aureus er et av de viktigste patogenene å studere i sammenheng med infeksjonssykdommer i samfunnet, da det de seneste årene er observert en betydelig økning av resistente stammer mot antibiotika. For å kunne utvikle nye samt forbedre eksisterende behandlingsmetoder mot S. aureus, er det helt nødvendig å få en større forståelse for essensielle cellulære mekanismer i arten. Celledeling kreves for overlevelse i S. aureus, og både proteinene og mekanismene involvert er derfor potensielle nye angrepspunkt for antibiotika. SmdA («staphylococcal morphology determinant A») er et membranprotein i S. aureus som ble identifisert blant konserverte stafylokokkproteiner med ukjent funksjon. Et tidligere studie av SmdA har vist at det er essensielt for rett utført celledeling og morfologi i S. aureus, og at SmdA deplesjon fører til økt sensitivitet mot celleveggangripende antibiotika. I dette arbeidet ble proteinstrukturen og funksjonen til SmdA nærmere studert for å få en større forståelse for hvordan proteinet er involvert i, eller påvirker, de ulike stegene under cellesyklus og deling. Selv om det i dette arbeidet ikke var mulig å bekrefte den predikerte membrantopologien til SmdA, ble det likevel vist at membranlokaliseringen samt det predikerte NERD-domenet og C-terminus er viktig for proteinfunksjon. Det ble innledningsvis observert at et nedregulert uttrykk av SmdA resulterer i celler med defekt cellemorfologi, forårsaket av flere aktive punkter med peptidoglykansyntese og dermed flere dannede septa. Sammenlignet viste et overuttrykk av SmdA tilsvarende defekter, men cellene ble observert med en lavere frekvens. Samtidig ble det også vist at det nedregulerte uttrykket av SmdA påvirker lokaliseringen av celledelingsproteinet EzrA, og dermed også den videre koordineringen av divisomet. Resultatene i dette arbeidet indikerer i tillegg at SmdA har en bredere rolle tilknyttet termosensitivitet og stresstoleranse. Vekstanalyser viste at S. aureus verken kan vokse ved høyere temperaturer eller indusere termotoleranse uten SmdA. Målt mengde proteinaggregater i celler uten SmdA indikerer også at fraværet av proteinet fører til mindre aggregatdannelse, mulig som følge av det oppregulerte uttrykket av Clp-proteiner med chaperon-aktivitet vist i en RNA-sekvensering. SmdA ble også bekreftet å ha en sammenheng med ica-operonet, da SmdA deplesjon fører til et nedregulert uttrykk av ica og signifikant mindre biofilmdannelse i S. aureus. Et av de store spørsmålene etter arbeidet er likevel hvorfor termostabiliteten reduseres ved økt temperatur uten SmdA, selv om mengden proteinaggregater samtidig reduseres og ekspresjonen av Clp-proteinene øker.

Staphylococcus aureus is one of the most important pathogens to study in conjunction with infectious diseases in the community due to the increased observations of resistant strains against antibiotics. To develop new as well as improving existing treatment methods against S. aureus, it’s necessary to obtain a deeper knowledge of essential cellular mechanisms in the species. Cell division is required for S. aureus viability, and both proteins and mechanisms involved could be new potential targets for antibiotics. SmdA («staphylococcal morphology determinant A») is a membrane protein identified among conserved staphylococcal proteins with unknown function. A previous study of this protein has demonstrated that SmdA is essential for proper cell division and morphology in S. aureus, and that a depletion results in increased sensitivity against cell wall targeting antibiotics.

In this work both protein structure and function of SmdA was studied to get a deeper insight into how the protein is involved, or affects, the different steps in the cell cycle and division. Even though we were not able to confirm the predicted membrane topology of SmdA, we were still able to show that the membrane localization as well as the predicted NERD domain and Cterminal part is important for protein function. It was initially observed that a downregulated expression of SmdA resulted in cells with morphological defects caused by several active sites with peptidoglycan synthesis thus multiple septa. Overexpression of SmdA led to similar defects, although the cells were observed with a lower frequency. At the same time a downregulated expression of SmdA was shown to affect the localization of the cell division protein EzrA, and as a result the further coordination of the divisome. The results obtained in this work also indicate that SmdA has a larger role related to thermosensitivity and stress tolerance. Growth analysis shows that S. aureus are not able to grow at higher temperatures nor induce thermotolerance without SmdA. The measured quantity of protein aggregates in cells without SmdA indicates that the absence of this proteins leads to less aggregates, possibly because of the upregulated expression of Clp-proteins with chaperon activity shown in an RNA sequencing. This work also confirmed a functional link between SmdA and the ica-operon where SmdA depletion leads to downregulation of ica and significant decreased biofilm formation in S. aureus. One of the big questions after this work is why the thermostability is reduced with increased temperature without SmdA even though the quantity of protein aggregates is reduced and the expression of Clp proteins increases.