Antibiotics against bovine mastitis pathogens : resistance and novel targets

Abstract

Bovine mastitis is the most frequent disease of dairy cattle and the major cause of antibiotic usage in dairy production. It causes impaired animal wellbeing, economical losses and food waste all over the world. This thesis contains two subprojects related to antibiotics and antibiotic resistance among mastitis-associated bacteria. The microbiota of the healthy udder and different pathogens associated with mastitis have been studied previously, but there is still limited knowledge about antibiotic resistant bacteria in this environment. In this work, resistant bacteria of the healthy udder have been investigated by screening milk samples for isolates resistant to penicillin G and amoxycillin-clavulanic acid, two antibiotics commonly used to treat bovine mastitis. To identify these bacteria, MALDI- TOF MS and Illumina 16S rRNA gene sequencing, were used. Resistant strains of common mastitis pathogens, such as Staphylococcus aureus and Corynebacterium bovis, environmental bacteria, such as Escherichia coli and Enterococcus faecalis, and bacteria known to be part of the healthy microbiota, such as Staphylococcus thermophilus were identified. The minimal inhibitory concentrations of the antibiotics of some of these strains were also found, resulting in surprising findings with some strains displaying very high MIC50-values. Another aspect of bovine mastitis that were studied was how genes of the major mastitis pathogen S. aureus are involved in susceptibility towards the commonly used antibiotics penicillin G and trimethoprim-sulfamethoxazole (TMP-SMX). For this purpose, a genome- wide CRISPRi-library was used to downregulate each gene and investigate the fitness effect of every gene in S. aureus during exposure to antibiotics. The method was found to be a useful tool for screening all the genes of S. aureus. However, this work also illustrated the importance of doing follow-up experiments to verify these findings. Several genes already known to be involved in tolerance to antibiotics were found, such as glmS, feoB and pbp4, which are involved in penicillin G resistance. Additionally, new genes were found to make the cell more sensitive to the antibiotics when downregulated. For instance, genes putatively involved in DNA metabolism, either by uptake of nucleoside (nupC and nupG), DNA repair (ung and polA) or DNA segregation (noc), were found to be essential upon TMP-SMX treatment. Moreover, a novel gene, not yet characterized, SAOUHSC_02121 was found to make the cell more sensitive to TMP-SMX when depleted. This gene ́s functionality should be investigated further.

Mastitt er den mest utbredte sykdommen blant melkekyr og den vanligste årsaken til antibiotikabruk i melkeproduksjon. Sykdommen forårsaker nedsatt dyrevelferd, økonomiske tap og matsvinn over hele verden. I denne oppgaven har to delprosjekter relatert til antibiotika og antibiotikaresistens blant mastitt-assosierte bakterier blitt gjennomført. Mikrobiotaen i friske jur og patogener knyttet til mastitt har blitt studert tidligere, men det er fremdeles lite kunnskap om antibiotikaresistente bakterier i dette miljøet. I dette arbeidet har resistente stammer fra friske jur blitt undersøkt ved å screene melkeprøver for bakterier resistente for penicillin G og amoxicillin-klavulansyre, to antibiotika som er vanlige å bruke i behandling av mastitt. For å identifisere disse bacteriene ble , MALDI-TOF MS og Illumina 16S rRNA gensekvensering, benyttet. Vanlige mastitt-patogener, som Staphylococcus aureus og Corynebacterium bovis, miljøbakterier, som Escherichia coli og Enterococcus faecalis, og bakterier kjent for å være en del av frisk mikrobiota, som Staphylococcus thermophilus ble funnet å være resistente bakterier i melka fra friske kyr. For antibiotikaene brukt ble minste inhiberende konsentrasjoner (MIC) også funnet, noe som resulterte i overaskende funn der noen stammer hadde svært høye MIC50-verdier. Videre ble også S. aureus, et viktig mastitt-patogen studert ved å undersøke hvordan genene påvirker følsomheten for de ofte brukte antibiotikaene penicillin G og trimetoprimsulfametoksazol (TMP-SMX). Til dette formålet ble et helgenom CRISPRi-bibliotek benyttet, for å nedregulere hvert gen, slik at genets effekt på cellens fitness ved påvirkning av antibiotika kan undersøkes. Denne metoden viste seg å være en nyttig metode for å screene alle genene til S. aureus. Samtidig viste dette arbeidet viktigheten av å gjøre oppfølgingsforsøk for å verifisere funnene fra screeningen. Flere gener som allerede er kjent for å være involvert i antibiotikaresistens ble funnet, slik som glm, feoB og pbp4, som alle er involvert i penicillin G resistens. I tillegg ble det funnet nye gener som ved nedregulering gjør cellen mer sensitiv for antibiotika. For eksempel ble gener som er antatt å være involvert i DNA metabolismen funnet å være essensielle ved TMP-SMX-behandling, enten ved opptak av nukleosider (nupC og nupG), DNA reparasjon (ung og polA) eller DNA segresjon (noc). Dessuten ble et nytt gen, SAOUHSC_02121, som enda ikke har blitt karakterisert, funnet å gjøre cellen mer sensitiv for TMP-SMX ved deplesjon. Spesielt dette genets funksjonalitet burde undersøkes videre.