Identifikasjon og kvantifisering av 7 benzodiazepiner, 2 metabolitter og 2 z-hypnotika ved hjelp av UHPLC MS/MS

Abstract

Det er utviklet en væskekromatografisk metode for identifikasjon og konsentrasjonsbestemmelse av 7 benzodiazepiner, 2 metabolitter og 2 z-hypnotika, i serum. Komponentene metoden omfatter er zopiklon, zolpidem, klonazepam, nitrazepam, flunitrazepam, lorazepam, oksazepam, alprazolam, temazepam, nordiazepam og diazepam. Alle komponentene i metoden har dedikerte deutererte internstandarder bortsett fra flunitrazepam. Denne komponenten benytter seg av klonazepam-d4. Den kromatografiske separasjonen utføres på kolonnen InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 2,1x100 mm 2,7 micron. Det benyttes gradienteluering med surgjort 5 mM ammoniumformatbuffer pH 3,1 og metanol. Gradientprogrammet starter på 95 % buffer og 5 % MeOH. Etter 20 sekunder økes MeOH til 60 % slik at komponentene gradvis starter å eluere. Etter 2 minutter økes MeOH ytterligere til 80 %. Her holdes den i ett minutt før den i nok et minutt økes til 100 % for å vaske ut eventuelle gjenværende stoffer. Systemet bruker ett minutt for å komme tilbake til startgradient slik at det stabiliseres før neste injeksjon. Den totale analysetiden er på 6 minutter. Alle komponenter har to unike MRM overganger, de deutererte internstandardene har en MRM overgang. Sammen med en stabil retensjonstid, danner dette grunnlaget for sikker identifisering av de ulike benzodiazepinene. Standarder med konsentrasjoner i et relevant måleområde muliggjør kvantifisering av de ulike komponentene i metoden. Prøveopparbeidelsen benytter SLE teknikk på plater med eter-eluering. Prøvematerialet blandes med internstandard, vann og ammoniumkarbonatbuffer før tilsetting på platen. Eluatet tørkes inn og reløses i mobilfase; ammoniumformatbuffer og metanol 1:1. Metoden ble validert etter laboratoriets prosedyre for metodevalidering; D 34518, som bygger på NS-EN ISO 15189. Valideringen viser at presisjon og repeterbarhet i hovedsak ligger innenfor laboratoriets krav på 10 % for CV og bias. Riktighet over tid blir kontrollert ved et eksternt kvalitetsprogram samt laboratoriets egne kontrollrutiner. Lineariteten til metoden er tilfredsstillende med R2 for alle komponenter over 0,99. Måleområdet er relevant i forhold til de konsentrasjoner som er forventet å finne ved anbefalt dosering, samtidig som det tar høyde for konsentrasjoner som finnes ved misbruk og overforbruk. LOQ konsentrasjonen for komponentene er halve konsentrasjonen av laveste standard for den enkelte komponent. Kravet på 20 % for CV og bias ved LOQ er innfridd. LOD konsentrasjonen er 1:5 av LOQ konsentrasjonen for alle komponentene, bortsett fra for flunitrazepam. Den er 1:2 av LOQ. Dette innfrir kravet for LOD, hvor begge MRM overgangene skal ha signal/støy ratio på over 3. Det er ikke funnet overdrag i metoden og metoden er stabil ved til små endringer i buffersammensetningen når det gjelder retensjonstid og respons. Sammenligning med en eksisterende metode ved Universitetssykehuset i Nord-Norge viser god korrelasjon mellom de to metodene. Ferdig opparbeidede prøver er holdbare; syv dager i autosampler ved 4 oC.

A liquid chromatographic method has been developed for the identification and quantification of 7 benzodiazepines, 2 metabolites and 2 z-hypnotics in serum. The method include the compounds zopiclone, zolpidem, clonazepam, nitrazepam, flunitrazepam, lorazepam, oxazepam, alprazolam, temazepam, nordiazepam and diazepam. All compounds in the method have dedicated deuterated internal standards except flunitrazepam. This compound uses clonazepam-d4. The chromatographic separation is performed on the column InfinityLab Poroshell 120 EC/C18 2.1x100 mm 2.7 microns. A gradient elution with acidified 5 mM ammonium formate buffer pH 3.1 and methanol is used. The gradient program starts with 95 % buffer and 5 % MeOH. After 20 seconds, MeOH increases to 60 %, so the analytes gradually begin to elute. After 2 minutes MeOH is further increased to 80 %. Here it is kept for one minute before it is increased to 100 % for another minute to wash out any remaining compounds. The system uses one minute to return to the starting gradient so that it stabilizes before the next injection. The runtime is 6 minutes. All compounds in the method have two unique MRM transitions, the internal standard have one MRM transition. Together with a stable retention time, this forms the basis for secure identification of the various benzodiazepines. Standards with concentrations in a relevant measuring range, enable quantification of the compounds in the method. The sample preparation is being processed on SLE plates with ether-elution. The sample material is mixed with internal standard, water and ammonium carbonate buffer, before adding to the plate. The eluate is dried and reconstituted in mobile phase, ammoniumformatebuffer and methanol 1:1. The method was validated according to the laboratory’s procedure for method validation; D 34518, based on NS-EN ISO 15189. The validation shows that the precision and repeatability are mainly within the laboratory’s requirement of 10 % for CV and bias. Long time accuracy is checked by an external quality program as well as the laboratory’s own control routines. The linearity for the method is satisfactory with an R2 for all the analytes above 0.99. The measuring range is relevant in relation to the concentrations that are expected to be found at the recommended dosage, and it also includes high concentrations which are found during abuse and over-consumption. The LOQ concentration of the compounds is half the concentration of the lowest standard for each compound. The requirement of 20 % for CV and bias, is satisfactory. The LOD concentration is 1:5 of the LOQ concentration for all the compounds, except for flunitrazepam. LOD for flunitrazepam is 1:2 of the LOQ. These concentrations fulfils the requirement for LOD, where both MRM transitions must have a signal/noise ratio of more than 3. No carry-over have been found in the method and the method is stable in relation to small changes in the buffer composition as it comes to retention time and response. Comparison with an existing method at the University hospital in Northern-Norway, shows a good correlation between the two methods. Preparated samples are stable; seven days in autosampler at 4 oC.