Surface display of cellobiose 2- epimerases on lactic acid bacteria for conversion of lactose to epilactose

Abstract

An increasing body of research elicits the many health benefits imparted by the gut-associated microbiota to their host. These beneficial strains are referred to as probiotic organisms. One way to promote growth and increase activity of probiotic strains is ingestion of prebiotic compounds. Several promising prebiotics are under development, such as epilactose. The methods for epilactose production have previously been prohibitively expensive and wasteful for sufficient production for it to be used as a prebiotic. This is changing, as several cellobiose 2-epimerases (CEases) have been shown to convert lactose into epilactose, making large-scale production of epilactose possible. The bacterial CEases utilized in this thesis are derived from Caldicellulosiruptor bescii (CbCEP) and Roseburia faecis (RfCEP). The pSIP system was used to fuse each CEase with a lipoprotein anchor (Lipo) and a LysM domain anchor (LysM), allowing for construction of inducible plasmids for surface-display of the CEases. The plasmids were transformed to Limosilactobacillus reuteri and Lactiplantibacillus plantarum and the recombinant strains were characterized in enzyme activity assays for their ability to convert lactose to epilactose. The assay samples underwent High Performance Anion Exchange Chromatography (HPAEC) with Pulsed Amperometric Detection (PAD) for carbohydrate separation and analysis using the ICS-6000. The analysis showed two recombinant L. reuteri and all recombinant L. plantarum produced epilactose. The L. plantarum harboring Lipo-Rf and LysM-Rf for surface-display of RfCEP were selected for more in-depth analysis. The best epilactose producer was L. plantarum harboring Lipo-Rf, yielding an epilactose fraction of 30 %, even when bacteria had been frozen for up to 48 hours at -20 °C. L. plantarum harboring LysM-Rf yielded epilactose fractions of 16 %, which was reduced to 8 % after freezing, showing how the anchoring strategy affects RfCEPs tolerance to freezing. Attempts to reuse bacteria for multiple reactions proved unsuccessful, as the production of epilactose declined in reactions with recycled cells, proving all strains were unfit for multiple cycles. The pSIP system was used successfully for surface display of CbCEP and RfCEP in L. plantarum, using a lipoprotein- and a LysM domain anchor. The recombinant strains were used as biocatalysts in enzyme activity assays, producing epilactose from lactose.

En økende mengde forskning peker ut helsegevinster forbundet med den kommensale mikrofloraen i tarmen. De gunstige artene kalles gjerne probiota og en måte å øke deres vekst og aktivitet i tarmen er å innta prebiotiske midler. Flere lovende prebiotika er under utvikling, for eksempel epilaktose. Produksjon av epilaktose har tidligere vært svært kostbar, lite miljøvennlig og for ineffektiv til å produsere tilstrekkelige mengder til bruk som prebiotika. Dette ble endret da det ble oppdaget at flere cellobiose 2-epimeraser (epimeraser) kan konvertere laktose til epilaktose, noe som muliggjør en industriell produksjon av epilaktose. De bakterielle epimerasene undersøkt i denne oppgaven er isolert fra Caldicellulosiruptor bescii (CbCEP) og Roseburia faecis (RfCEP). Det plasmidbaserte pSIP systemet ble brukt til å konstruere plasmider hvor hver epimerase ble fusjonert med et lipoprotein-anker (Lipo) og et LysM domene-anker (LysM). Plasmidene ble transformert til Limosilactobacillus reuteri og Lactiplantibacillus plantarum for å utrykke epimerasene på celleoverflaten. De rekombinante stammene undersøkt i aktivitets-forsøk for deres evner til å konvertere laktose til epilaktose. Prøver høstet fra aktivitetsforsøk ble analysert ved High Performance Anion Exchange Chromatography (HPAEC) med Pulsed Amperometric Detection (PAD) i en ICS-6000 for å måle innhold av karbohydrater. Resultatet av analysene viste at to rekombinante L. reuteri-stammer og alle rekombinante L. plantarum-stammer produserte epilaktose. L. plantarum med plasmidene Lipo-Rf og LysMRf, som begge ankret RfCEP, ble valgt ut for videre analyser. Den beste produsenten av epilaktose viste seg å være L. plantarum med Lipo-Rf, denne stammen produserte en epilaktose-fraksjon på 30 %, selv etter nedfrysning ved -20° i opptil 48 timer. L. plantarum med LysM-Rf oppnådde en epilaktose-fraksjon på 16%, men etter nedfrysning sank produksjonsevnen til 8%, noe som viser at ankermetoden påvirker RfCEPs toleranse til nedfrysning. Forsøk der bakteriene ble høstet og gjenbrukt i flere reaksjoner viste tydelig at stammene ikke var egnet til dette formålet. pSIP-systemet lot seg anvende for overflateankring av CbCEP og RfCEP og de rekombinante stammene ble brukt i biokatalytiske reaksjoner for å konvertere laktose til epilaktose.