Cocoons from Hermetia illucens as photosensitizer for photobiocatalytic LPMO reactions

Abstract

An increasing global focus on reducing fossil fuel-derived emissions, has led to a demand for environmentally friendly and renewable alternatives. Cellulose and chitin, two of the most abundant biopolymers in Nature, have proven to be valuable biomaterials that can replace crude oil in the production of fuels, chemicals, and other materials. However, these biopolymers are crystalline and very demanding to degrade. The discovery of LPMOs in 2010 has revolutionized the understanding of how these crystalline materials are degraded by oxidative enzymes in cooperation with glycoside hydrolases. LPMOs are Cu-dependent oxidoreductases that depend on a reduced copper in the active site and O2 or H2O2 as a co-substrate. Previous studies have shown the ability of a photosensitizer, i.e., chlorophyllin, or an inorganic photocatalyst, vanadium doped TiO2, to generate reducing equivalents and H2O2 for LPMO catalysis. The research presented in this thesis aimed to investigate the photosensitizing abilities of a natural material that LPMOs may encounter in Nature, namely pupal exuviae from an insect, Hermetia illucens.

The pupal exuviae from Hermetia illucens used in the research described in this thesis were provided by Dr. Thomas Hahn at the Fraunhofer Institute. Prior to the research, the raw material of these pupae were analyzed for their content of chitin (23-25%) and catechols (10%). Insoluble catechols are aromatic components with phenolic groups and have a chemical structure comparable to lignin, which is a known activator of LPMO catalysis. Here, we analyzed whether light-exposed fine-milled cocoon powder of Hermetia illucens (FMC), with its content of insoluble catechols, can provide a cellulose-active LPMO, ScAA10C, with reducing equivalents and co-substrate (H2O2) to catalyze the depolymerization of microcrystalline cellulose, Avicel. Activity assays were performed with different amounts of FMC, LPMO, Avicel and different light intensities to address the effects of these variables on LPMO activity. To assess the role of superoxide in the photobiocatalytic system, experiments with superoxide dismutase were carried out. Furthermore, the amplex red assay was used to measure the accumulation of H2O2. Finally, we assessed whether chitin in the FMC and β-chitin could be degraded by a chitin-active LPMO, SmAA10A, using FMC as photosensitizer.

The results showed that light-exposed FMC acts as an excellent photosensitizer to sustain ScAA10C and SmAA10A activity. The observations showed that increasing the FMC concentration and the light intensity led to increased progress curves and production of LPMO products (i.e., oxidized sugars). In contrast, the increase of LPMO concentrations did not show any effect, showing that the reactions were limited by the FMC/light system. The LPMO became less active at higher substrate concentrations which is likely due to the light attenuating properties of the substrate, limiting the production of H2O2. The addition of superoxide dismutase to the reactions did not affect the production of oxidized products, indicating that reduction of O2 to H2O2 happened in one step, and not via superoxide. Inactivation of ScAA10C was observed in a reaction with high (10 g/L) amounts of FMC and light intensity corresponding to 10% of Imax, most likely due to overproduction and accumulation of H2O2, which results in futile H2O2-turnover by the LPMOs. Interestingly, reactions with SmAA10A showed light-driven degradation of chitin in the FMC, meaning that the material can act as a photosensitizer for its own oxidative degradation reactions. Reactions with β-chitin showed light-driven FMC-catalyzed efficient degradation by SmAA10A, conforming the potential of FMC as a general photosensitizer for promoting LPMO catalysis.

Et økt globalt fokus på å redusere utslipp av fossilt brennstoff, har ført til krav om å finne mer miljøvennlige og fornybare alternativer. Cellulose og kitin, to av de mest utbredte biopolymerene i Naturen, har vist seg å være verdifulle biomaterialer som kan erstatte råolje i produksjon av drivstoff, kjemikalier og andre materialer. Disse biopolymerene er krystallinske og svært krevende å bryte ned. Oppdagelsen av LPMOer i 2010 har revolusjonert forståelsen av hvordan disse krystallinske materialene brytes ned av oksidative enzymer i samarbeid med glykosidhydrolaser. LPMOer er Cuavhengige oksidoreduktaser som er avhengige av et redusert kobber i det aktive setet samt tilgang på enten O2 eller H2O2 som kosubstrat. Tidligere studier har vist hvordan fotosensibiliserende stoffer som klorofyllin, og en uorganisk fotokatalysator, vanadium dopet TiO2, kan generere reduserende ekvivalenter og H2O2 for å katalysere LPMO-aktivitet. Målet med denne oppgaven var å undersøke de fotosensibiliserende evnene til et naturlig materiale som LPMOer kan møte på i Naturen, nemlig pupperester fra et insekt, Hermetia illucens. Rester av pupper fra Hermetia illucens benyttet i denne studien ble tilsendt fra Dr. Thomas Hahn ved Fraunhofer Institutt som et fotosensibiliserende stoff. Råmaterialet til disse puppene ble forut for studien analysert for sitt innhold av blant annet kitin (23-25%) og katekoler (10 %). Uløselige katekoler er aromatiske forbindelser med fenolgrupper bundet til seg og har en kjemisk struktur sammenlignbar med lignin, en kjent aktivator for LPMO-katalyse. I denne oppgaven undersøkes det om lyseksponert finmalt kokongpulver av Hermetia illucens (FMC), med sitt innhold av uløselige katekoler, kan bistå en celluloseaktiv LPMO, ScAA10C, med reduserende ekvivalenter og kosubstrat (H2O2) for katalyse av enzymatisk nedbrytning av mikrokrystallinsk cellulose, Avicel. Aktivitetsanalyser ble gjennomført med ulik mengde FMC, LPMO, Avicel samt ulik lysintensitet for å adressere disse ulike variablenes effekt på LPMO-aktivitet. For å vurdere superoksids rolle innen det fotobiokatalytiske systemet, ble eksperimenter med superoksid dismutase gjennomført. Videre ble det foretatt amplex red analyser for å måle på akkumulert mengde H2O2. Til slutt ble nedbrytning av kitin i FMC og β-kitin demonstrert ved bruk av en kitinaktiv LPMO, SmAA10A, fotokatalysert av FMC. Resultatene viste at lyseksponert FMC er et utmerket fotosensibiliserende stoff for katalyse av ScAA10C- og SmAA10A-aktivitet. Observasjonene viste at ved økte FMC-konsentrasjoner og lysintensiteter, økte produksjonsraten og den totale produksjonen av LPMO produkter (dvs. oksiderte sukre). I motsetning, viste ikke økte LPMO-konsentrasjoner til noen effekt, hvilket vil si at LPMO aktiviteten i det gjeldene systemet var begrenset av FMC og lys. LPMOen ble mindre aktiv ved tilsetning av økte mengder substrat som mest sannsynlig forklares av substratets lysattenuerende egenskaper, noe som begrenser produksjon av H2O2. Tilsetning av superoksid dismutase til reaksjonene påvirket ikke produksjonen av oksiderte produkter, noe som indikerer at reduksjon av O2 til H2O2 skjer i ett trinn, og ikke via superoksid. Inaktivering av ScAA10C ble observert i en reaksjon tilsatt høy (10 g/L) konsentrasjon av FMC eksponert med en lysintensitet tilsvarende 10 % av Imax. Denne inaktiveringen kan mest sannsynlig forklares av en overproduksjon og opphopning av H2O2 som ikke LPMOene klarer å omsette. I tillegg viste ScAA10A til lysdrevet nedbrytning av kitin i FMC, hvilket betyr at FMC kan fungere som en fotosensibilisator for sine egne oksidative nedbrytningsreaksjoner. Observasjoner viste til lysdrevet FMC-katalysert effekt ved nedbrytning av β-kitin i reaksjoner med SmAA10A, hvilket bekrefter potensialet om bruk av FMC som en generell fotosensibilisator til å fremme LPMO-katalyse.