Multiresistens i bakterieisolater hentet fra akvatiske miljø : identifisering av ß- laktamaser med utvidet spektrum og karbapenamaser ved bruk av genotypiske og fenotypiske metoder

Abstract

Ikke lenge etter at antibiotika ble funnet og begynte å bli brukt som medisin, kom antibiotikaresistens (AR). Helt siden den gang har det vært en kamp mot organismer som videreutvikler resistens og forskere som hele tiden prøver å finne nye former for antibiotika. Gjennom årene har bakterier utviklet resistente for flere av de originale antibiotikaene, og har da utviklet utvidet spektrum ß-laktamaser (ESBL) som er til stor bekymring. Tidligere har fokuset kun vært på klinisk oppdagelse av antibiotikaresistens, og hvordan resistensen sprer seg humant. De siste årene har miljøets rolle innen AR kommet frem i lyset og man ser nå etter resistens som finnes naturlig i miljøet og resistens som erverves. Flere bakterier har vist seg å mutere fra villtypene og har dermed gått fra å være mottakelige for antibiotika til å bli resistente. Formålet med denne masteroppgaven er å undersøke tilstedeværelsen av ESBL- og karbapenamaseproduserende bakterier i akvatiske miljø, i tillegg til å se på resistensgenene til disse. Totalt 10 vannprøver har blitt samlet inn fra Ås, Drøbak og Ski fra forskjellige vann. Det har blitt hentet prøver fra både sjø, tjern, bekk og dam. Vannet ble filtrert og spredd på selektivt kromogene medier for deteksjon av ESBL og karbapenamaser. Fra alle bakterieisolater ble det sendt 16S rRNA til Sanger-sekvensering for indemnisering. For å detektere ESBLenzymer ble det benyttet multiplex PCR-produkter som ble kjørt på en gelelektroforese. Et utvalg av prøver basert på fenotype, identifisering og multiplex-resultater ble sent til helgenomsekvensering med Illumna MiSeq for å se etter resistensgener. I tillegg ble det også sett på virulensgener. Det ble også utført antimikrobiell sensitivitetstesting av bakterieisolatene for å se resistensen mot 5-10 ulike antibiotika. Fra 16S rRNA Sangersekvensering ble bakteriene identifisert som Bordetella, Enterobacter, Stenotrophomonas, Yersinia og Rahnella. Et sjette isolat Escherichia coli ST1193 ble senere hentet inn og tatt med i studien. Flere av prøvene var «multidrug»- resistente (MDR), og hadde opp til flere resistens- og virulensgener. Noen av observasjonene har det blitt gjort funn av tidligere, men lite er dokumentert om funn av Y. enterocolitica med karbapenemresistens. Flere av isolatene inneholdt ampC-genet som er å finne både kromosomalt og på plasmider. Genet CTX-M ble funnet hos E. coli og fra Rahnella ble det gjort funn av et RAHN-gen nært beslektet til CTXM. Studien konkluderer med at det er tilstedeværelse av MDR organismer med produksjon av ESBL i både Andedammen og Smilehullet i Ås.

Not long after the discovery of antibiotics and its usage in medicine, antibiotic resistance (AR) appeared. It has since been a fight against organisms that further develops resistance, and scientist are attempting to discover new forms of antibiotics continuously. Bacteria have developed resistance against several of the original antibiotics through the years and have developed Extended Spectrum Beta-Lactamase (ESBL), which is of great concern. Previously, the focus has been on clinical discovery of antibiotic resistance and how resistance spreads humanely. The environmental role within AR has in the last years been shed light on, and the focus is now on resistance appearing naturally in the environment and acquired resistance. Several bacteria have been shown to mutate from their wild types and have therefore gone from being susceptible to antibiotics to become resistant. The aim of this thesis is to investigate the presence of ESBL- and carpabenamase-producing bacteria in aquatic environments, and to investigate their genes for resistance. In total 10 water samples have been collected from Ås, Drøbak and Ski from different water sources. Samples have been collected from the sea, ponds, streams, and dams. The water was filtered and spread on selective kromogene mediums for detection of ESBL and carpabenamases. From all bacterial isolates, 16S rRNA was sent to Sanger sequencing for identification. To detect ESBL-enzymes multiplex PCR was performed, and products were run on gel electrophoresis. Samples were selected based on their phenotype, identification, and multiplex results, and were sequenced using Whole Genome Sequencing by Illumina Miseq to detect genes for resistance. Additionally, genes for virulence were analyzed. Moreover, antimicrobial sensitivity tests of the bacterial isolates were performed to identify the resistance against 5-10 different antibiotics. From 16S rRNA Sanger sequencing were the bacteria Bordetella, Enterobacter, Stenotrophomonas, Yersinia and Rahnella identified. A sixth isolate of Escherichia coli ST1193 were added later on in the study. Several of the samples were “multidrug”-resistant (MDR) and possessed several resistancesand virulence genes. Some of the observations in this study have been observed in previous studies, but there is little documentation of findings of Y. enterocolitica with karbapenemresistance. Several isolates contained the ampC-gene which can be found both on chromosomes and in plasmids. The gene CTX-M were found in E. coli and in Rahnella there was a discovery of a RAHN-gene closely related to CTX-M. The results concludes that there is a presence of MDR organisms with production of ESBL in both Andedammen and in Smilehullet in Ås.