Deteksjon og kvantifikasjon av HRV87 i A549 celler med og uten Neu5Ac in vitro

Abstract

Forkjølelse er et dagligdags problem som forårsakes av ulike varianter av rhinovirus. Rhinovirus er en av de vanligste årsakene til luftveisinfeksjoner og står for omlag 50 % av tilfellene. Forskningslitteraturen viser til at flere luftveisvirus, inkludert noen varianter av rhinovirus, bruker sialinsyre på celleoverflaten som reseptor for å ta seg inn i epitelcellene i kroppen vår. Formålet med denne studien har vært å utarbeide RT-qPCR metode for deteksjon av HRV87 og undersøke om Neu5Ac påvirker virusets replikasjon.

HRV87 ble kultivert til virusstock i etablert A549 cellekultur. Virusstock ble brukt som utgangspunktet for valideringen av RT-qPCR metoden og i arbeid med in vitro celledyrkingsforsøkene. TCID50 ble utført for å gi et mål på mengden virus som skaper effekt i cellene. In vitro celleforsøkene har undersøkt HRV87 sin evne til å gjennomgå replikasjon ved tilstedeværelse av Neu5Ac. Utviklingen av HRV87 har blitt vurdert innenfor 0 til 96 timer med Neu5Ac konsentrasjon fra 0,1 mM til 2,0 mM tilsatt dyrkingsmediet. Parallelt har Neu5Ac sin påvirkning på levedyktighet til A549 celler blitt vurdert.

RT-qPCR metoden presenterer vellykket kvantifisering og deteksjon av HRV87. Metodens effektivitet, spesifisitet, sensitivitet og variasjon er vurdert. TCID50 ble beregnet til 10- konsentrasjonen av HRV87 som skaper CPE i 50 % av cellene. In vitro celledyrkingsforsøkene viser at Neu5Ac ikke har noen effekt på HRV87 utover 72timer. Ved lavere virus konsentrasjoner, med forutsetningen om tilstrekkelig Neu5Ac til stede, ble det observert endring ved HRV87 tilsatt 0,1 mM og 1,0 mM Neu5Ac etter 24 timer og 48 timer. Relativ endring ble registrert ved HRV87 kultivert med 0,2 mM og 0,8 mM Neu5Ac etter 24 timer.

Denne studien er utarbeidet med forutsetning om at A549 cellene hadde gjennomgått en cellesyklus før prøvemateriale ble tatt ut, hvor det i løpet av syklusen har blitt x virspartikler tatt opp og reprodusert. Effekten av Neu5Ac vurderes på allerede etablert viruskultur. Alle resultatene tatt i betraktning, så konkluderte en med at denne studien presenterer en RT – qPCR metoden for deteksjon av HRV87 som også oppfattet variasjoner i mengde virus. 0,2 mM og 0,8 mM er de eneste Neu5Ac konsentrasjonene som viste effekt i form av relativ endring etter 24 timer. Indikasjonene som er gitt gjennom denne studien må videre følges opp med mer detaljerte undersøkelser.

Colds are an everyday problem caused by different varieties of rhinovirus. Rhinovirus is one of the most common causes of respiratory infections and accounts for about 50% of cases. The research literature indicates that several respiratory viruses, including some variants of rhinovirus, use sialic acid on the cell surface as a receptor to enter the epithelial cells in our body. The purpose of this study has been to develop an RT-qPCR assay for detecting HRV87 and to investigate whether Neu5Ac affects the replication of the virus. HRV87 was cultured for virus stock in established A549 cell culture. Virus stock was used as starting point for the validation of RT-qPCR and in work with in vitro cell culture experiments. TCID50 was performed to give a measure of the amount of virus that creates an effect in the cells. In vitro cell experiments have examined HRV87's ability to replicate in the presence of Neu5Ac. The development of HRV87 has been rated within 0 to 96 hours with varying Neu5Ac concentration from 0.1 mM to 10 mM Neu5Ac added to the culture medium. In parallel, the effect of Neu5Ac on the viability of A549 cells has been assessed. The RT-qPCR method presents successful quantification and detection of HRV87. The method's effectiveness, specificity, sensitivity, and variation have been assessed. TCID50 was calculated to be 10-5 concentration of HRV87 that creates CPE in 50% of cells. In vitro cell culture experiments show that Neu5Ac does not affect virus beyond 72 hours. With the assumption of sufficient Neu5Ac present at lower virus concentrations, change in HRV87 was added with 0.1 mM and 1.0 mM Neu5Ac after 24 hours and 48 hours. Relative change was recorded in HRV87 cultured with 0.2 mM and 0.8 mM Neu5Ac after 24 hours. This study has been prepared on the assumption that the A549 cells had undergone a cell cycle before sample material was taken out, where x virus particles have been taken up and reproduced during the cycle. The effect of Neu5Ac is assessed on already established virus culture. Taking all the results into account, one concluded that this study presents an RT - qPCR method for detecting HRV87, which also perceived variations in the amount of virus. 0.2 mM and 0.8 mM are the only Neu5Ac concentrations that showed an effect in terms of relative change after 24 hours. The indications given through this study must be further followed up with more detailed studies.