Human CaMKIIδ mutanter – proteinekspresjon, rensing, krystallisering og analyse av SN-peptid binding

Abstract

I denne oppgaven var målet å løse den 3-dimensjonale strukturen av komplekset mellom et peptid fra Sekretoneurin (SN) og Calmodulin (CaM) avhengig kinase IIδ (CaMKIIδ). Det ble derfor laget flere ulike mutanter av CaMKIIδ, til uttrykking, rensing, bindingsanalyse mellom CaMKIIδ og SN-peptidet. Under normale forhold vil CaMKIIδ binde seg til Calmodulin og bli aktivert ved fosforylering av treonin 287 i det autoregulatoriske domenet, som er lokalisert fra aminosyre 281-316. Det er vist at hjertesvikt gir en økning av SN-nivået, SN binder til CaMKIIδ og hemmer aktiviteten til kinasen som er assosiert med hjertesvikt.

Det er derfor av stor interesse å studere i detalj strukturen av komplekset mellom SN-peptidet og kinasen CaMKIIδ, også med henblikk på design av nye forbindelser som kan binde til og regulere aktiviteten til kinasen.For å se på proteinstrukturen til komplekset mellom SN-peptidet og CaMKIIδ valgte vi å følge 3 ulike strategier; design av trunkerte former av CaMKIIδ, design av aktivert CaMKIIδ ved hjelp av fosforyleringsmimikk, og design av mutanter av CaMKIIδ med SN-peptid motivet inkludert i det autoregulatoriske domenet.

Det ble laget flere trunkerte mutanter av CaMKIIδ uten det autoregulatoriske domenet som kan forhindre binding av SN-peptidet; CaMKIIδ264 og CaMKIIδ275, hvor sekvensen stopper ved henholdsvis aminosyre 264 og 275. Forsøkene viste av disse mutantene ikke ble uttrykt fra plasmidet pNIC28-Bsa4, i motsetning til den noe lengre formen som stopper ved aminosyre 335, CaMKIIδ335. Det ble videre laget to konstrukter for mutanter av en annen trunkert form av CaMKIIδ, denne gang med stopp ved residue 280. Kinasen ble fusjonert med NusA, et protein som kan gi økt løselighet. Av de to konstruktene, NusA-CaMKIIδ280 og NusA-extended-CaMKIIδ280, var det ene ikke uttrykt mens det andre ga god ekspresjon, men ikke noe løselig protein. Det ble laget en siste trunkert mutant, CaMKIIδ291, hvor sekvensen stoppet midt i det autoregulatoriske domenet. Denne formen var uttrykt og løselig, men det var ikke tid til å utvikle en renseprotokoll.

Det ble videre laget en mutant som skulle mimikere den aktive CaMKIIδ, hvor treonin er fosforylert, ved å erstatte treonin 287 med aspartat. Denne mutanten av CaMKIIδ, også i plasmidet pNIC28-Bsa4, hadde god ekspresjon, men var ikke løselig. Strukturen av CaMKIIδ335 bundet til CaM er tidligere publisert, og basert på en analyse av dette komplekset ble det besluttet å sette inn SN-peptidsekvensen i det autoregulatoriske domenet til proteinet. Dette er basert på en sekvenssammenstilling av SN-peptidet og nevnte domene i CaMKIIδ. Blant de konserverte residuene finner vi blant annet fosforyleringssetet treonin 287. Innsettingen ble gjort i to steg ved setedirigert mutagenese. Det ble dermed laget to mutanter med henholdsvis halve og hele SN-peptidet satt inn; CaMKIIδ1/2SN og CaMKIIδSN. Disse mutantene var godt uttrykt, men ved MS analyse viste det seg at CaMKIIδSN fragmenterte og aggregerte under rensing.

Da ingen av de 3 strategiene ga rent løselig protein med høyt utbytte for krystallisering, gikk vi tilbake til den lengre formen CaMKIIδ335. Det ble etablert en rensemetode for CaMKIIδ335 som ga rent protein. Renset CaMKIIδ335 ble benyttet til bindingsanalyser ved hjelp av mikroskalatermoforese, men ingen binding mellom CaMKIIδ335 og SN-peptidet ble påvist under de gitte betingelser. Det ble i tillegg utført screening med over 800 krystalliseringsbetingelser av proteinkomplekset mellom CaMKIIδ og SN-peptid og proteinkomplekset CaMKIIδ, SN-peptidet og CaM. Det ble funnet 5 krystalliseringsbetingelser som må studeres nærmere og evt optimaliseres.

Ettersom de ulike CaMKIIδ mutantene var vanskelig å fremstille og rense, og i mangel på en eksperimentell struktur av komplekset mellom CaMKIIδ og SN-peptidet ble det laget flere peptid-dockingmodeller av komplekset mellom SN-peptidet og CaMKIIδ som viser mulige strukturer av komplekset.