Innledende kinetikkstudier av den lytisk polysakkarid monooksygenasen, SmAA10A, ved bruk av stopped-flow spektrofotometri og isotermisk titreringskalorimetri

Abstract

De kobberavhengige enzymene kjent som lytisk polysakkarid monooksygenaser (LPMO-er) katalyserer den oksidative nedbrytningen av polysakkarider som kitin og cellulose ved spalting av glykosidbindinger. Under denne prosessen benytter LPMO-er seg av en reduktant i tillegg til et av kosubstratene H2O2 eller O2. Disse katalytiske egenskapene til LPMO-er har gitt dem en sentral rolle innen forskningen på fremtidige bioraffineringsprosser hvor bærekraftig biomasse kan benyttes til bioøkonomiske formål. Denne mastergradsavhandlingen inngår som en del av et større forskningsprosjekt hvor målet er å avdekke ny kunnskap om den molekylære mekanismen til LPMO-er. Arbeidet i denne oppgaven benyttet metoder som stopped-flow spektroskopi og isotermisk titreringskalorimetri.

Den iboende forskjellen i emittert fluorescens mellom SmAA10A-Cu(II) og SmAA10A-Cu(I) ble utnyttet til å bestemme reduksjonshastigheten for SmAA10A og kosubstratet H2O2 under anaerobe miljøforhold. Hastigheten (k1app) for reduksjonen av SmAA10A var av størrelsesorden 105, 103 og 104 M-1 s-1 ved pH 7 med henholdsvis L-askorbinsyre, gallussyre og L-cytein. For reduksjonen med L-Cystein ble det observert en moderat binding av reduktanten til enzymet med en bindingskonstant (KD1) i orden av 10-4 M-1 s-1, med en tilhørende førsteordens hastighetskonstant (k1) på 4.1 s-1. En svak økning i reduksjonshastigheten ble observert ved pH 8 for alle reduktanter. For å enkelt kunne studere reduksjonen av hydrogenperoksid med SmAA10A-Cu(I) ble det utviklet og optimalisert en ny stopped-flow metode. De resulterende reduksjonshastighetene etter intiell reduksjon av SmAA10A-Cu(II) med enten L-askorbinsyre, gallussyre eller L-cystein var da av størrelsesorden 103 M-1 s-1.

Stopped-flow resultatene antyder at hverken reduksjonen av SmAA10A eller H2O2, ved tilstedeværelse av antioksidantene L-askorbinsyre, gallussyre og L-cystein, er hastighetsbestemmende trinn i den molekylære mekanismen til LPMO-er. Det viste seg også at reduksjonshastigheten for SmAA10A er avhengig av reduktanten som benyttes. ITC-metoden viste potensiale, men er i nåværende tilstand uegnet til bestemmelse av kinetiske- eller termodynamiske parametere for oksidaseaktiviteten til fritt kobber og LsAA9A. Datamaterialet presentert i denne oppgaven utgjør dermed et grunnlag for videre studier på veien mot å avdekke mulige hastighetsbestemmende trinn i den oksidative mekanismen til LPMO-er.

The copper dependent enzymes known as lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) can catalyse the oxidative cleavage of glycosidic bonds found in polysaccharides such as chitin and cellulose. During this process LPMOs utilize a reductant as well as one of its cosubstrates H2O2 or O2. The catalytic properties of LPMOs have resulted in them attracting great interest within scientific community for their potential application in biorefining processes where economical gains can be made from the degradation of sustainable biomass. This thesis is a part of a larger research project that hopes to uncover new knowledge about the molecular mechanism of LPMOs. The work presented in this thesis employs methods such as stopped-flow fluorescence spectroscopy and isothermal titration calorimetry (ITC).