Lysophosphatidic acid (LPA) regulation of collective cell migration

Abstract

The human body is covered by a protective barrier, the skin. The skin is daily subjected to cuts and bruises, wounds that are normally healed without scars. However, sometimes the wound healing process of the skin fails, and chronic wounds is formed. In order to develop new and non-invasive strategies to improve the healing process in chronic wounds, it is necessary to fully understand the mechanisms of wound healing. Collective cell migration is an essential process of wound healing. Cell migration requires filament structures in the cytoskeleton, in particular, formation of actomyosin networks. Lysophosphatidic acid (LPA) is involved in many biological functions. LPA has the ability to promote migration of keratinocytes and fibroblasts, and thereby participate in wound repair. The mechanisms for LPAs regulatory role in wound healing are not fully established. The aim of this master project is therefore to contribute to a better understanding of how LPA activates and regulates collective cell migration in human skin. The research is based on an established in vitro experimental system including the human keratinocyte cell line HaCaT. Cell movements in quiescent epithelial sheets were monitored by live cell imaging to study migration patterns formed after different stimuli. The mRNA expression levels of the six LPA receptors (LPARs) in HaCaT cells were estimated. Furthermore, visualization of actomyosin networks was performed using immunofluorescence (IF) staining and live cell imaging of a HaCaT cell line expressing fluorescent labelled actin. The effect of the LPAR1 inhibitor Ki16425 was examined based on cell migration patterns and actomyosin expression. Finally, a LPAR1 knockdown cell line was established using the shRNA technique. Western blot analysis was used to evaluate the knockdown efficiency and changes in cell morphology and migration behaviour were examined. The results showed that LPA was able to activate and regulate collective cell migration of keratinocyte cell sheets and it was observed a correlation between actomyosin networks and cell sheet coordination. It was also estimated expression of all six LPARs in HaCaT cells, but LPAR4 was expressed in lower amount. LPAR1 was observed to be important for LPAs regulatory role of collective cell migration, but it was not alone involved in these responses.

Menneskekroppen er dekket av en beskyttende barriere, huden. Huden blir daglig utsatt for kutt og merker, sår som normalt heler uten å etterlate arr. Likevel kan det forekomme feil i sårhelingsprosessen som medfører kroniske sår. For å kunne utvikle nye non-invasive strategier for å forbedre helingsprosessen i kroniske sår, er det nødvendig å forstå mekanismene for sårhelingsprosessen fullt ut. Kollektiv cellemigrering er en essensiell prosess for sårheling. Cellemigrering avhenger av filamentstrukturer i cytoskjelettet, spesielt actomyosin. Lysofosfatidsyre (LPA) er involvert i mange biologiske funksjoner. LPA har evnen til å fremme migrering av keratinocytter og fibroblaster, og dermed inngå i sårhelingsprosessen. Mekanismene for LPAs regulatoriske rolle i sårheling er ikke fullstendig etablert. Målet med dette masterprosjektet er derfor å bidra til en bedre forståelse for hvordan LPA aktiverer og regulerer kollektiv cellemigrering i menneskehud. Forskningen er basert på et etablert in vitro eksperimentelt system som inkluderer den humane keratinocytt-cellelinjen HaCaT. Cellemigrering i et hvilende epitelcellelag ble studert ved levende cellemikroskopi for å undersøke migreringsmønstre som dannes av ulike stimuli. Uttrykksnivået av mRNA for de seks LPA-reseptorene (LPAR) i HaCaT-celler ble estimert. Videre ble actomyosin-nettverk visualisert ved bruk av immunofluorescens (IF) og mikroskopi av en HaCaT-cellelinje som uttrykker fluorescerende aktin. Effekten av LPAR1 inhibitoren Ki16425 ble undersøkt basert på cellemigreringsmønstre og uttrykk av actomyosin. Til slutt ble det laget en cellelinje med nedregulert LPAR1 ved bruk av shRNA-teknikk. Analyser med Western blot ble utført for å evaluere effekten av nedregulering i cellelinjen, og endringer i cellemorfologi og migreringsegenskaper ble undersøkt. Resultatene viste at LPA hadde evnen til å aktivere og regulere kollektiv cellemigrering i keratinocytt-cellelag, og det ble observert en korrelasjon mellom actomyosin-nettverk og koordinering av celler i cellelag. Det ble også estimert uttrykk av alle seks LPAR i HaCaTceller, men LPAR4 var uttrykt i mindre mengder. Observasjoner viste at LPAR1 var viktig for den regulatoriske rollen til LPA i kollektiv cellemigrering, men LPA var ikke involvert i disse responsene alene.