A novel pig cell line as model system for calcineurin inhibitors
Master thesis
View/ Open
Date
2015-03-17Metadata
Show full item recordCollections
- Master's theses (KBM) [940]
Abstract
Organtransplantasjon kan være nødvendig i situasjoner med organsvikt som følge av sykdom eller skade. Det totale antallet transplantasjoner øker, og transplantasjoner ansees fortsatt som utfordrende. Høy kongruens av immunsystemet mellom mottaker og donor er nødvendig for å hindre at immunsystemet angriper det transplanterte organet og dermed redusere risikoen for avstøtningsreaksjoner. Allogen transplantasjon krever ofte immunsupprimerende behandling for å hemme immunforsvaret. Immunsupprimerende behandling har alvorlige bivirkninger, inkludert nefrotoksisitet, en skade på nyreceller forårsaket av trykkøkning i nyre kar. Forekomsten av nefrotoksisitet grunnet immunsupprimerende midler kan bli studert i mennesker, dyr eller cellemodeller. Cyclosporin A og Tacrolimus er kjente immunsuppressiva som brukes innenfor transplantasjon for å hindre eller hemme avstøtningsreaksjon av transplantatet. Det er av interesse å studere toksisiteten og de metabolske effektene av disse medikamentene, og cellekulturer og dyremodeller kan være nyttig å bruke til dette. Cellulære modeller tar ikke hensyn til endringer i blodtrykk, hormonelle forandringer, eller effekten av andre organer, men de gir en mulighet til å undersøke direkte toksisitet av medikamenter. Gnagere er mye brukt i dyrestudier, men vi har valgt en nyrecellelinje fra gris, EFN-R, som er hentet fra Friedrich-Loeffler-Institut (FLI) i Tyskland. Griser viser egenskaper som i noen tilfeller er nærmere mennesket enn gnagermodeller og vi har derfor valgt å bruke denne cellelinjen som et modellsystem i vårt laboratorium.
Det var et ønske å karakterisere EFN-R celle linjen. Metoder som flowcytometri og immunoblotting ble brukt til dette. Flowcytometri indikerte at EFN-R besto av en cellepopulasjon. For ytterligere å karakterisere fenotypen av EFN-R-celler, undersøkte vi fordelingen av proteinmarkører inkludert System N1 (SN1) aminosyre transportør, Megalin (Lrp2), Tamm-Horsfall protein (THP) og Aquaporin 2 (Aqp2). SN1 er en glutamin transportør lokalisert i proksimale tubuli. Her finner vi også transmembranproteinet Lrp2. THP og Aqp2 er lokalisert i Henles sløyfe, distale tubuli og samlekanalen i nyrens nefroner. Immunoblotting fant tilstedeværelse av SN1, THP og Lrp2 i EFN-R. Aqp2 hadde lavere mobilitet enn forventet så vi kunne verken bekrefte eller avkrefte tilstedeværelse av dette proteinet. Disse funnene tyder på at EFN- R cellelinje ligner proksimale tubuli celler.
V
Dose responskurve av Cyklosporin A og Tacrolimus viste doseavhengighet og redusert metabolisme vurdert av MTT. Morin beskyttet mot reduksjon i MTT spaltning noe som indikerer at toksisiteten som utøves av Tacrolimus delvis var mediert av oksidativt stress. Middels og lav dose av Cyclosporin A og Tacrolimus endret ikke uttrykket av apoptose relaterte gener som Bax, og Bcl2. Høy dose er fremdeles ikke testet på cellene.
Multiresistens protein 4 (Mrp4) er en nyre transportør som finnes i proximale tubuli celler, og som deltar i medikament distribusjon. En lav dose Cyclosporin A økte ekspresjon av Mrp4. Mrp4 forble uendret etter tilsatt Tacrolimus.
Konklusjon: Våre data indikerer at EFN-R cellelinje består av en cellepopulasjon, med protein markører som minner om proksimale tubulære celler. Morin beskytter og indikerer at oksidativt stress kan spille en rolle i calcineurin hemmer (CNI) toksisitet i denne cellelinjen. En lav dose Cyclosporin A økte ekspresjon av Mrp4, hvorav Mrp4 forble uendret i celler tilsatt Tacrolimus.
Det neste trinnet i dette prosjektet vil være å undersøke tilstedeværelse av protein markørene THP og Aqp2 i EFN-R. Metoder som western blot og sekvensering kan være nyttige til dette. Våre resultater viser en økning av Mrp4 på mRNA nivå. Neste trinn vil være å undersøke om mRNA translateres til protein ved bruk av western blot. Ved tilstedeværelse av protein vil det være aktuelt å utføre siRNA for å få mer kunnskap om regulering av Mrp4 i proximale tubuli.