Molecular characterization of single tumor cells in breast cancer

Abstract

Breast cancer is the most common cancer among women in Norway, with 3726 new cases and 598 deaths registered in 2019. The five-year relative survival rate has increased and is now at 92%. Breast cancer is one of the few cancer types where patients can experience relapse of the disease many years after the initial diagnosis and treatment. To-day, there are no established diagnostic markers that can predict the risk for late relapse. Breast cancer patients can have tumor cells residing in the bone marrow, so-called micrometastases. Such single disseminating tumor cells (DTCs) can be dormant for years. For breast cancer patients with dormant DTCs in the bone marrow, it is important to understand how they might be activated and form metastases after many years. Information about molecular features of such cells would therefore be of major interest. Sequencing of single cells is a technique that have increased in the last decade, due to better technology and more interest in the heterogeneity and cell-to-cell variation, both in tumors and for rare cell populations. The phenotype of cells is defined by the transcriptome, as the transcription of RNA and translation into proteins defines the activities in a cell. It is therefore of critical importance to have a standard method for RNA isolation from single cells to allow single cell transcription analysis. Single cell RNA sequencing has mainly been by sequencing of many individual unselected cells in suspension, but rarely of selected individual single cells. A “pipeline” for identification and selection of rare tumor cells by a process that results in RNA of high amount and quality, would be of great value. The aim of this thesis was to compare the RNA output from four methods with different processes for identification and selection of single tumor cells, as detailed analysis of the RNA demands optimal concentration, fragment lengths and suitability for PCR amplification. A cell line with epithelial tumor cells from breast was used for testing of the methods. The RNA extracted from selected single cells, was tested for amount, quality and amplificability. Further, DTCs from two breast cancer patients were identified and selected by one of the methods and subjected to RNA extraction and quality control.

Brystkreft er den vanligste formen for kreft blant kvinner i Norge, med 3726 nye tilfeller og 598 registrerte dødsfall i 2019. Den fem-års relative overlevelsesraten har økt og er nå på 92%. Brystkreft er en av de få kreft typene hvor pasienter kan oppleve tilbakefall av sykdommen mange år etter første diagnose og behandling. Til dags dato er det ingen gode diagnostiske markører som kan predikere risikoen for slike sene tilbakefall. Brystkreftpasienter kan ha kreft celler i benmargen, såkalte mikrometastaser. Slike spredte, disseminerte kreftceller (DTC) kan være inaktive (dormant) i flere år. For brystkreftpasienter med DTC i benmargen er det viktig å forstå hvordan de kan aktiveres og danne metastaser etter mange år. Informasjon om molekylære trekk ved slike celler vil derfor være av stor interesse. Sekvensering av enkeltceller er en teknikk som har blitt mer brukt de siste tiårene, på grunn av bedre teknologi og en økt interesse i heterogenitet og celle-til-celle variasjon, både i svulster og for sjeldne cellepopulasjoner. Cellers fenotype er definert av transkriptomet, ettersom transkripsjonen av DNA til RNA og translasjonen deretter til proteiner definerer aktivitetene til en celle. Det er derfor kritisk viktig å ha en standardmetode for isolasjon av RNA fra enkeltceller, for å kunne få til sekvensering av enkeltcelle-transkriptomet. Sekvensering av enkeltcelle-RNA har hovedsakelig vært ved sekvensering av mange individuelle uselekterte celler i suspensjon, men sjelden av utvalgte individuelle enkeltceller. Å ha en «pipeline» for identifikasjon og seleksjon av sjeldne tumorceller, som klarer å gi RNA av høy mengde og kvalitet, vil derfor være viktig. Målet med denne masteroppgaven var å sammenligne RNA mengden etter bruk av fire metoder med ulike identifikasjons og seleksjons prosesser av enkelte tumorceller. Dette fordi en detaljert sekvenseringsanalyse av RNA krever optimal konsentrasjon, større fragmenter og egnethet for PCR amplifikasjon. En cellelinje med epiteliale tumorceller fra bryst ble brukt til testing av metodene. RNA ekstrahert fra de utvalgte enkeltcellene ble testet for mengde, kvalitet og amplifiserbarhet. Videre ble DTC fra to brystkreftpasienter identifisert og selektert med en av metodene etterfulgt av RNA analyse.