Involvement of ionotropic glutamate- and TRPA1 receptors in oligodendrocyte response to ischemia in human cerebral organoids

Abstract

Stroke is the second leading cause of disability worldwide and is the most common cause of severe disability in Norway. 11 000 new cases occur every year in Norway, where 80-85 % are caused by cerebral artery blood clots or emboli, named ischemic stroke. Current treatment options for ischemic stroke are limited, and there is a need for new treatments that can reduce brain tissue damage after a stroke. Several neuroprotective agents have been developed, but none of the agents have passed clinical trials despite the success in preclinical studies. One reason for this could be because previous studies have ignored the importance of glial cells in stroke pathophysiology: the human brain has a much higher proportion of glial cells than other animals, and the number of oligodendrocytes is particularly high. Oligodendrocytes are the cells that myelinate axons and are crucial for neuronal signalling and their death leads to neuronal dysfunction. In stroke, neurons and oligodendrocytes are killed by mechanisms involving calcium overload, but new studies suggest that the upstream mechanisms differ between the two cell types. The different upstream mechanisms could explain the limited effects of neuroprotective agents on human stroke patients, since neuronal dysfunction will persist when oligodendrocytes are not rescued. Thus, saving the oligodendrocytes may be a significant factor in protecting brain tissue after an ischemic stroke and the scientific community urging to produce new experimental models to bridge the gap between animals and humans.

The aim of this thesis was to unravel mechanisms that cause oligodendrocyte injury in ischemic stroke. This was achieved by investigating the effect of inhibiting TRPA1-, NMDA- and AMPA receptors on oligodendrocyte survival after ischemia. Human cerebral organoids were produced from human induced pluripotent stem cells and were used as a model for the human brain. By immunohistochemistry, the results showed that inhibition of TRPA1 receptors increased the number of oligodendrocytes after ischemia. However, TRPA1 receptor inhibition also increased the overall number of apoptotic cells in non-ischemic conditions. By using RNA-FISH, TRPA1 receptor was detected in the human cerebral organoids, but methodological challenges prevented localization in specific cell types. Immunohistochemistry did not show any significant effect of NMDA- and AMPA receptor inhibition. Regardless, the results revealed large variations between the organoids and there is a need to improve the quality controls during development or include larger sample sizes in the experiments.

Hjerneslag er den nest vanligste årsaken til uførhet verden og er den mest vanlige årsaken til alvorlig funksjonshemming i Norge. Hvert år er det 11 000 nye tilfeller i Norge hvor 80-85% er iskemiske hjerneslag, forårsaket av cerebral blodpropp eller emboli. Det er et stort behov for nye behandlingsformer som kan redusere ødeleggelsen av hjernevevet etter et slag, hvor nåværende behandling er svært begrenset. De siste årene har flere nevrobeskyttende midler blitt er utviklet, men ingen har blitt godkjent i kliniske studier til tross for preklinisk suksess. En av grunnene kan være at tidligere studier har ignorert viktigheten av gliacellene i hjerneslagets patofysiologi: menneskehjernen har en større andel gliaceller enn andre arter hvor antallet av oligodendrocytter er spesielt høyt. Oligodendrocytter er de cellene i sentralnervesystemet som myeliniserer aksonene og er helt avgjørende for nevronsignalisering hvor oligodendrocytt-død fører til nevronal dysfunksjon. Ved hjerneslag dør nevroner og oligodendrocytter av mekanismer som involverer kalsium-overflod, men nyere studier viser at oppstrømsmekanismen er ulik. Ulik oppstrømsmekanisme kan forklare den begrensende effekten av nevrobeskyttende midler hos mennesker fordi nevronal dysfunksjon vil vedvare hvis oligodendrocyttene ikke overlever. Dermed kan hindring av oligodendrocytt-død være en viktig faktor for å beskytte hjernevevet etter hjerneslag og forskningsmiljøet oppfordrer til å utforske nye, eksperimentelle metoder for å dekke avstanden mellom ulikhetene mennesker og dyr. Målet med denne oppgaven var å avdekke mekanismer som forårsaker skade på oligodendrocytter ved iskemisk hjerneslag. Dette ble oppnådd ved å utforske effekten av oligodendrocyttene etter hjerneslag ved å blokkere TRPA1-, NMDA- og AMPA reseptorene. Humane cerebrale organoider var produsert fra human induserte pluripotente stamceller og var brukt som modell for den menneskelige hjernen. Ved å bruke immunohistokjemi viser resultatene at inhibering av TRPA1 reseptoren økte antallet av oligodendrocytter etter hjerneslag. Samtidig økte antallet av apoptotiske celler i organoider som ikke hadde fått indusert hjerneslag. Ved å bruke RNA-FISH ble TRPA1 reseptoren detektert i humane cerebrale organoider, men metodologiske utfordringer hindret lokalisering i spesifikke celletyper. Immunohistokjemi viste ingen signifikant effekt av å inhibere NMDA eller AMPA reseptorene. Resultatene viste likevel stor variasjon blant organoidene og det er dermed nødvendig å forbedre enten kvalitetskontroller gjennom organoide-dyrking eller inkludere større prøvemengder i eksperimentene.