Microenvironment models and the effect of metformin on energy metabolism in cervical cancer cell lines

Abstract

Bakgrunn: På tross av gode prognoser for livmorhalskreft hvis oppdaget tidlig, får en tredjedel av pasienter med avanserte stadier tilbakefall etter behandling med kjemoradioterapi. Det er derfor et behov for å forstå biologien bak disse tumorene for å forbedre resultatet av behandling. Ved å omprogrammere metabolismen kan kreftceller utvikle fordeler ovenfor normale celler, som økt proliferasjon og overlevelse under spesialiserte mikromiljø med trekk som hypoksi, høy laktatkonsentrasjon og lav pH. Dette bidrar til kreftprogresjon. Metformin, en vanlig diabetes-medisin, har fått økt interesse innen kreftbehandling ettersom den har vist seg å hemme kreft-metabolisme. Denne studien hadde som mål å undersøke in vitro effekter av forskjellige mikro-miljøforhold og metformin på to livmorhalskreftcellelinjer. Spesielt ble nytten av Seahorse-teknologi, som er spesielt egnet til studier av metabolisme, for disse undersøkelsene evaluert.

Metoder: Cellelinjene HeLa og SiHa ble brukt som modeller for livmorhalskreft. Tre mikro-miljømodeller ble etablert ved å dyrke cellene under ulike forhold: 1) hypoksi, 2) høy laktat-konsentrasjon (laktosis) og 3) høy laktatkonsentrasjon og lav pH (laktisk acidose). Hypoksi-modellen ble etablert ved å stabilisere HIF-1α, et viktig protein i hypoksiresponsen, ved å bruke CoCl2. Laktat ble tilsatt +/- HCl for å etterligne mikromiljøene rike på laktat ved normal og lav pH. Effekter på proliferasjon ble undersøkt gjennom celletelling, og mitokondriell masse ble studert ved hjelp av fluorescenssignal fra et fluorokrom som binder seg til mitokondriene (MitoTracker Green), detektert av en plateleser. Effekter på metabolismen ble studert ved hjelp av et Seahorse-instrument.

Resultater: Resultatene avslørte at proliferasjon ble hemmet av CoCl2 i SiHa-celler, men hadde ingen effekter på HeLa-celler. Laktisk acidose reduserte proliferasjon i begge cellelinjer, mens laktosis ble funnet å øke mitokondriell masse i HeLa-celler. Ingen effekter av metformin ble funnet på proliferasjon eller mitokondriell masse i noen av mikromiljømodellene. Derimot ble metformin funnet å påvirke cellulær metabolisme ved å hemme oksidativ fosforylering på en doseavhengig måte ved bruk av Seahorse-instrumentet.

Konklusjoner: Resultatene indikerer at Seahorse-teknologi bør implementeres i fremtidig forskning for å øke forståelsen av cellulær metabolisme under forskjellige mikromiljøforhold og for å avdekke de metabolske effektene av metformin.

Background: Although the prognosis is good for cervical cancer if detected early, about one third of the patients with advanced cervical cancer stages relapse after chemoradiotherapy treatment. There is therefore a need to understand the biology of these tumours better to improve treatment outcome. By reprogramming cellular metabolism cancer cells can develop advantages over normal cells, increasing proliferation rates and survival under specialised tumour microenvironments with features such as hypoxia, high lactate concentration and low pH. This contributes to cancer progression towards increased malignancy. The diabetic drug metformin has recently received increased interest for cancer treatment as it has been found to target cellular metabolism. This study aimed to investigate in vitro effects of different microenvironmental conditions and metformin on two cervical cancer cell lines. In particular, the usefulness of Seahorse technology, which is especially useful for studies of metabolism, was evaluated. Methods: The cell lines HeLa and SiHa were used as models for cervical cancer. Three microenvironment models were established by culturing the cells under different conditions: 1) hypoxia, 2) high lactate concentration (lactosis) and 3) high lactate concentration and low pH (lactic acidosis). The hypoxia model was established using CoCl2 to stabilize HIF-1α, which is crucial in the hypoxia response. Lactate was added +/- HCl to mimic microenvironments rich in lactate at normal and low pH. Effects on proliferation were investigated through cell counting, and mitochondrial mass was studied using fluorescence signal from Mitotracker Green, as detected by a plate reader. Effects on metabolism was studied using a Seahorse analyser. Results: The results revealed that proliferation was inhibited by CoCl2 in SiHa cells but had no effects on HeLa cells. Lactic acidosis decreased proliferation in both cell lines, while lactosis was found to increase mitochondrial mass in HeLa cells. No effects of metformin were found on proliferation or mitochondrial mass in any of the microenvironment models investigated. However, using the Seahorse analyser metformin was found to affect cellular metabolism by inhibiting oxidative phosphorylation in a dose dependent manner. Conclusions: The results indicate that Seahorse analyser should be implemented in future research to better understand cellular metabolism under different microenvironmental conditions and to reveal the metabolic effects of metformin.