Infrarød spektroskopi og størrelsesfordelingskromatografi for analyse av industrielt relevante parametere innen enzymatisk protein hydrolyse

Abstract

Matindustrirelevante parametere som grad av hydrolyse (DH %), gjennomsnittlig molekylvekt (Mw) og proteininnhold (Protein %) kan brukes for å effektivisere matproduksjonen, samtidig som det er med på å forbedre opplevelsen og kvaliteten på produktet. Ved en on-line analyse er det mulig å kvalitetssikre råvarer ved å se på disse parameterne. Fourier transform infrarød spektroskopi (FT-IR) har vist seg å være en rask, enkel og billig måte å kontrollere parameterne på. Samtidig utmerker størrelsesfordelingskromatografi (SEC) seg i industrisammenheng ved å kunne brukes på store mengder prøve som en strømlinjeformet og automatisert prosess. Begge metodene har et stort potensial innen industrien. For å utnytte egenskapene ble delvis minste kvadraters (PLSR-) modeller opprettet gjennom kjemometri. Det har tidligere blitt vist at for MPH er det mulig å predikere både DH % og Mw. I denne oppgaven blir samme modellering brukt på restråstoffer fra laks og kylling, i tillegg til tre melkeråstoff. Restråstoffene ble først og fremst forbehandlet, deretter gikk proteinene gjennom en enzymatisk proteinhydrolyse (EPH). De ble så videre analysert gjennom FT-IR, SEC, Dumas metode og 2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre (TNBS-metoden) før dataene ble bearbeidet ved bruk av multivariat analyse. For å identifisere mulige uteliggere ble dataene først visualisert gjennom ned-dimensjoneringsmetoden PCA. Etter korrigering ble PLSR-modellering brukt for å lage prediktive modeller av alle 3 proteinhydrolysatene. Modelleringen av MPH bekreftet en sterk korrelasjon for både DH % og Mw med henholdsvis R2-verdi på 0.95, 0.94, og RMSECV på 1.1% og 278.5 g/mol. SEC analysen påviste en sterk korrelasjon mellom kromatogrammet og proteininnholdet med R2-verdi på 0.97 og RMSECV på 0,75 %. Derimot ble det vist en svak korrelasjon mellom SEC og DH % med R2-verdi på 0,51 og RMSECV på 12.2 %. Det ble vist at det var ingen til svak korrelasjon mellom både KPH- og LPH-spekteret av DH %. Resultatene for Mw viste en R2-verdi på henholdsvis 0,79, 0.59 med RMSECV på 503 g/mol og 708,5 g/mo. Ved en sammenstilling av FT-IR og SEC ble kromatogrammene arealomgjort (F1-F4) for en bedre sammenstilling. Disse ga moderat gode resultater, med R2-verdiene for KPH rangert mellom 0,79-0,83 med en RMSECV mellom 0,8-2,77 %. For LPH ble R2-verdiene vist å rangere mellom 0,48-0,72 med en RMSECV på 0,96-3,56 %. Det ble diskutert at en bedre prøveopparbeidelse, et optimalisert instrument og kolonne og en annen detektor kan være med på å gi et mer representativt resultat. Samtidig kan et mer kompetent TNBS-forsøk påvirke resultatet i en mer representativ retning.

Degree of hydrolysis (DH %) average molecular weight (Mw) and protein content (Protein %) are food industry-relevant parameters used to improve both the production and the experience of foodstuff. Through on-line analysis it’s possible to ensure the quality of raw materials derived by these parameters. Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) have proven to be a quick, easy, and inexpensive way to control these. On the other hand, size exclusion chromatography (SEC) excels as an industrial tool from being able to analyze large quantities of samples in a streamlined and automated process. Both methods have a significant industrial potential. To take advantage of these properties, predictive models were created through chemometrics. It has previously been shown that from MPH it’s possible to predict both DH % and Mw. The same model will be used in this thesis on residual raw materials from both salmon and chicken, in addition to three milk raw materials. The residual raw materials were first pretreated before the proteins went through an enzymatic protein hydrolysis (EPH). They were then further analyzed through FT-IR, SEC, Dumas’method and 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS-method) before the data were processed using multivariate analysis. The data was first visualized through PCA to identify potential outliers. After correction, PLSR-models were established to make predictive models of all 3 protein hydrolysate sets. The PLSR-models of MPH confirmed a good predictive capability for both DH % and Mw with an R2 value of 0,95 and 0,94 respectively, and an RMSECV of 1,1 %, 278,5 g/mol. The SEC analysis showed a strong correlation between the chromatogram and the protein content with an R2 value of 0,97 and an RMSECV of 0,75 %. Moderate correlation was shown for SEC and DH % however, with an R2 value of 0,51 and RMSECV 12,2 %. For the industrial KPH and LPH the result was more variable and somewhat lower. It was shown that there is no to weak correlation between both the KPH and LPH spectrum when used to predict DH %. However, results for Mw showed better results with an R2 value of 0,79 and 0,59, and an RMSECV of 503 g/mol and 708,5 g/mol, respectively. Because of the size of the peptides and the columns exclusion range, the chromatogram was area converted and fractionized (F1-F4) after known sizes for a better comparison. These gave moderate to strong results. The R2 value for KPH ranged from 0,79-0,83 with an RMSECV between 0,8-2,77 %. For LPH the R2 value was shown to rank between 0,48-0,72 with an RMSECV of 0,96-3,56 %. It was also discussed that with better sample preparation, an optimized instrument and column whilst using a different detector can help give more accurate results. At the same time, a more competent TNBS experiment can influence the result in a more representative direction.