The establishment of a CRISPR-Cas13a diagnostic assay for SARS-CoV-2 detection

Abstract

The scarcity of fast and reliable tests in diagnostic laboratories for detection of pathogens with high sensitivity is a significant disadvantage particularly for critically ill patients. Given the global health crisis caused by the ongoing pandemic of Severe Acute Respiratory Syndrome 2 (SARS-CoV-2) that pervades today's society, rapid and robust infection detection is important in reducing virus spread. Novel technology based on CRISPR-Cas proteins has demonstrated improved diagnostic turnaround time whilst maintaining high specificity and sensitivity for viral and bacterial detection. The innovative platform called Specific, High sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing system (SHERLOCK) allows ultra-sensitive nucleic acid detection down to attomolar sensitivity and even single molecules in less than one hour. SHERLOCK combines an isothermal pre-amplification step to increase the amount of DNA or RNA with Cas13/Cas12 orthologues exhibiting high levels of collateral RNase activity upon recognition of a specific target sequence.

In this thesis, the aim was to establish a rapid and sensitive CRISPR-Cas13 diagnostic assay using a fluorescence-based SHERLOCK platform with reverse transcription (RT)- Recombinase polymerase amplification (RPA) for sequence-amplification and the Cas13a orthologue from Leptotrichia wadei (Lwa)Cas13a for detection of SARS-CoV-2. We aimed for fast SARS-CoV-2 detection with comparable sensitivity to the gold standard diagnostic method RT-qPCR. To establish a high sensitivity SHERLOCK assay, we focused on instrumentation, reaction components, and target optimization. Synthetic targets were used for the initial assay optimization and clinical SARS-CoV-2 samples to evaluate assay sensitivity and specificity. Targets included a region within the SARS-CoV-2 orf1ab- and orf1b- genes used in recent studies and two highly conserved regions within the N-gene identified by sequence alignment analysis.

Results in this work show that SHERLOCK maintained high specificity (95%) and a sensitivity of 86% for the detection of orf1ab, compared to RT-qPCR analysis of the SARS-CoV-2 E-gene. Within one hour, a significant (p≤ 0.001) signal from SARS-CoV-2 samples equal to a Ct value of 33,2 was obtained using, the novel target, MSA_T1, in SARS-CoV-2. The results demonstrate that correct instrument optimization is crucial in order to achieve high sensitivity as well as careful target sequence selection and iterative crRNA guide design. Results also reveal that the primary limitation on assay sensitivity is unspecific noise from the RPA reaction, suggesting that choice of primers play a critical role in assay optimization. The SHERLOCK platform has great potential in clinical diagnostics for rapid detection of pathogens, though sensitivity must be increased to obtain that achieved by RT-qPCR.

Knappheten på raske og pålitelige diagnostiske tester for påvisning av patogene bakterier og virus med høy følsomhet er en betydelig ulempe, spesielt for intensivavdelinger. På grunn av det globale helseproblemet forårsaket av alvorlig akutt luftveissyndrom corona 2 virus (SARS-CoV-2) er rask infeksjon-påvisning viktig for å redusere spredning av virus. Et stort press er satt på det norske helsevesenet, og testkapasiteten i landet. Ettersom viruset kan gi et spekter av symptomer, kan det ikke påvises basert på sykdomstegn. Ny teknologi basert på CRISPR-Cas har vist sitt potensiale til rask og sensitiv påvisning av virus og bakterier. Den innovative plattformen kalt Specific, High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing system (SHERLOCK) tillater sensitiv nukleinsyre-deteksjon ned til attomolar følsomhet på under en time. SHERLOCK kombinerer et isotermisk pre-amplifikasjonstrinn for å øke mengden nukleinsyrer i en prøve, med Cas13 / Cas12-ortologer som har en sekvens-uspesifikk trans-RNase-aktivitet ved gjenkjenning av en målsekvens. En vellykket etablering av en slik plattform kan redusere diagnostisk behandlingstid og samtidig opprettholde høy spesifisitet og følsomhet.

I denne oppgaven var målet å etablere en rask og sensitiv CRISPR-Cas13 diagnostisk plattform ved bruk av et fluorescens-basert SHERLOCK system for påvisning av SARS-CoV-2. Revers transkripsjon (RT)- Rekombinase Polymerase Amplifikasjon (RPA) ble brukt til pre-amplifisering, mens Cas13 fra Leptotrichia wadei (Lwa)Cas13a og assosierte crRNAer ble brukt til virus deteksjon. Vi ønsket en rask SARS-CoV-2 deteksjon med samme følsomhet som dagens diagnostiske gullstandard, RT-qPCR. For å etablere en SHERLOCK-plattform med høy følsomhet fokuserte vi på instrument-, reaksjons- og målsekvens optimalisering. Syntetiske mål-sekvenser ble brukt for analyseoptimalisering, og kliniske SARS-CoV-2 prøver ble brukt for evaluering av analysens følsomhet og spesifisitet. Målsekvensene inkluderte en region i SARS-CoV-2 orf1ab- og i orf1b-genet. To svært konserverte regioner i N-genet hentet fra en sekvensanalyse av SARS-CoV-2 genomet ble også brukt til SARS-CoV-2 deteksjon.

Resultatene viser at SHERLOCK hadde høy spesifisitet (95%) og en sensitivitet på 86% for påvisning av orf1ab. Høyest signifikans ble oppnådd ved bruk av en ny mål-sekvens, MSA_T1 hentet fra sekvensanalysen. Dette tilsvarte en RT-qPCR Ct-verdi på 33,2 av E-genet. Data fra denne oppgaven demonstrerte viktigheten av riktig instrumentoptimalisering og utstyr for å oppnå høy følsomhet i metoden. Resultatet fastslår også at den primære faktoren som begrenser analyse-sensitiviteten, er uspesifikt støy fra RPA-reaksjonen. Funnene tyder på at valg av RPA primere spiller den viktigste rollen i analyse optimalisering sammen med guide-RNA-design. SHERLOCK-plattformen har stort potensiale i klinisk diagnostikk, selv om sensitiviteten må økes for å oppnå tilsvarende nivå som RT-qPCR (95%).