Multiresistente bakteriestammer fra vannmiljøer : deteksjon av betalaktamaser med utvidet spektrum blant bakterieisolater ved bruk av fenotypiske og genotypiske metoder

Abstract

Utviklingen av antibiotikaresistens (AR) blant viktige patogene bakterier anses som å være en av de største helsetruslene globalt i moderne tid. Produsenter av ekstendert-spektrum betalaktamaser (ESBL) og karbapenemaser blant gram-negative Enterobacteriaceae er ansett som spesielt viktige faktorer i utviklingen av denne trusselen. Det er en voksende forståelse for miljøets viktige rolle både i utvikling og spredning av AR. Formålet med denne masteroppgaven var å undersøke forekomsten av ESBL-produserende bakterier i akvatiske miljøer, samt grad av klinisk resistens og virulens blant disse. Vannprøver ble samlet inn fra tre dammer på campus Ås ved Norges miljø- og biovitenskapelige universitet (NMBU), filtrert og grodd på selektivt kromogent medium for ESBL-deteksjon. 16S rRNA fra alle isolatene ble sendt til Sanger-sekvensering for identifikasjon. Det ble benyttet tre multipleks primermikser for genotypisk deteksjon av ESBL-enzymer i tillegg til to for å detektere karbapenemaser. PCR-produktene ble kjørt på 1 % gelelektroforese, og prøver med positivt bånd ble nøyere undersøkt med singelpleks PCR. Utvalgte prøver ble sendt til helgenomsekvensering med Illumina MiSeq for å identifisere virulens- og resistensgener, samt mer nøyaktig identifikasjon. Til slutt ble det utført antimikrobiell sensitivitetstesting (AST) av utvalgte isolater for å undersøke grad av AR mot 12 ulike antibiotika. Dette ble gjort ved hjelp av gradient-diffusjons metoden.

Fem bakterieisolater ble dyrket frem på det selektive mediet. Sanger-sekvensering av 16S rRNA antydet at isolatene tilhørte slektene Escherichia, Serratia, Pseudomonas og Lewinella. En av prøvene ble ikke identifisert. Helgenomsekvensering identifiserte to av isolatene som E. coli og S. fonticola. E. coli-stamme ble i tillegg identifisert som sekvenstype ST1193 serotype O75:K1:H5, og var «multidrug»-resistent (MDR) samt bar på en rekke virulensdeterminanter som var assosiert med uropatogene E. coli (UPEC). Stammen bar også ESBL-genet blaCTX-M-15. S. fonticola-stammen bar et blaFONA-gen, som er et iboende og kromosomalt ESBL-gen. E. coli-isolatet samt isolatet identifisert som en Lewinella-art i henhold til 16S rRNA sekvensering kunne på bakgrunn av AST-resultatene beskrives som MDR, og var resistente mot blant annet cefotaxim og trimetoprim. ST1193-stammen var resistent mot ciprofloxacin.

Det ble konkludert med at MDR organismer med produksjon av ESBL fantes i Andedammen og Niagara-dammen på campus Ås ved NMBU, både i form av miljøbakterier og en klinisk signifikant patogen E. coli-stamme.

The emergence of antibiotic resistance (AR) among important pathogenic bacteria is considered to be one of the greatest health threats globally in modern times. Bacteria producing extendedspectrum beta-lactamases (ESBL) and carbapenemases among gram-negative Enterobacteriaceae are considered particularly important factors in the development of this threat. There is a growing recognition of the important role of the environment in both the development and dissemination of AR. The purpose of this thesis was to investigate the presence of ESBL-producing bacteria in aquatic environments, as well as the degree of clinical resistance and virulence among them. Water samples were collected from three ponds on the Ås campus at the Norwegian University of Life Sciences (NMBU), filtered and grown on selective chromogenic medium for ESBL detection. 16S rRNA from all the isolates were sent to Sanger sequencing for identification. Three multiplex primer mixes were used for genotypic detection of ESBL enzymes in addition to two for the detection of carbapenemases. The PCR products were run on 1% gel electrophoresis, and positive band samples were examined more closely by singleplex PCR. Selected samples were sent for whole-genome sequencing with Illumina MiSeq to identify virulence and resistance genes, as well as more accurate identification. Finally, antimicrobial sensitivity testing (AST) of selected isolates was performed to examine the degree of AR against 12 different antibiotics. This was done using the gradient-diffusion method. Five bacterial isolates were grown on the selective medium. Sanger sequencing of 16S rRNA suggested that the isolates belonged to the genera Escherichia, Serratia, Pseudomonas and Lewinella. One of the samples was not identified. Whole-genome sequencing identified two of the isolates as E. coli and S. fonticola. The E. coli strain was additionally identified as sequence type ST1193 serotype O75:K:H5, and was multidrug resistant (MDR) as well as carrying a number of virulence determinants associated with uropathogenic E. coli (UPEC). The strain also carried the ESBL gene blaCTX-M-15. The S. fonticola strain carried a blaFONA gene, which is an intrinsic and chromosomal ESBL gene. The E. coli isolate as well as the isolate identified as a Lewinella species according to 16S rRNA sequencing could be described as MDR on the basis of the AST results and were resistant to cefotaxime and trimethoprim, among others. The ST1193 strain was resistant to ciprofloxacin. It was concluded that MDR organisms harbouring and producing ESBL were found in Andedammen and Niagara on the Ås campus at NMBU, both in the form of environmental bacteria and a clinically significant pathogenic E. coli strain.