Contribution of epigenetic and epitranscriptomic factors in gene regulation of embryonic stem cells : I. Generation of Ythdf1-3 knock-outs and characterization of their phenotypes. II. Investigating the role of a chromatin modifier, MMSET in R-loop biology

Abstract

Both epigenetic and epitranscriptomic modifications have been revealed to impact gene regulation and are linked to numerous diseases and oncogenic reprogramming. Reversible alterations in gene expression with no effects on the nucleotide sequence are defined as epigenetic regulation, while modifications occurring on RNA, the transcriptome, is known as epitranscriptomic regulation. The study aimed to investigate the contribution of epigenetic and epitranscriptomic factors in gene regulation of mouse embryonic stem (mES) cells by looking at two different aspects: the impact of the reader proteins YTHDF1-3 (DF1-3) on cellular processes in mES cells, and the role of a chromatin modifier, MMSET in R-loop biology.

The first aspect in this study examined the cytoplasmic reader proteins DF1-3, which recognize and bind N6-methyladenosine (m6A) modifications. The DF1-3 proteins are reported to promote translation and affect mRNA stability. Some studies suggest that DF1-3 possesses similar functions, due to their high sequence similarity, however, the majority of studies supports dissimilar functions. Hence, it remains to be elucidated how the DF proteins mediate different functions, and if they bind to the same or different m6A sites. We wanted to generate single- and double Df1-3 knock-outs (KOs) in mES cells to determine how DF1-3 affect proliferation and differentiation phenotypes. By creERT2 recombinase and CRISPR/Cas9 technology, we generated Df1, Df3, Df1/2, and Df1/3 KO cells. The observed growth capacity alterations in the Df knock-out cells were negligible. Furthermore, we tested the differentiation capacity, and the ability to differentiate was ¬affected in the generated knock-out cells, especially toward the neuroectoderm lineage. These findings coincide with literature reporting that epigenetic and epitranscriptomic alterations do not impact proliferation, but the differentiation ability in ES cells.

The second aspect reviewed the role of a chromatin modifier, MMSET in R-loop biology. MMSET is a histone methyltransferase, that additionally plays a role in pluripotency exit and mesendoderm specification. Moreover, MMSET is an interaction partner of R-loops, and several proteins have been revealed as common interaction partners of MMSET and R-loops. R-loop is a three-stranded structures that comprises a DNA-RNA hybrid and displaced single-stranded DNA. R-loops play a physiological role in cellular processes, in addition to a pathological role with a negative impact on transcription and replication, and are linked to DNA damage. Furthermore, R-loops have been reported to be enriched in polycomb group repressed genes. Hence, we wanted to validate MMSET as an interaction partner of R-loops, and further determine effects upon MMSET deletion.

By performing immunoprecipitation western blotting, we validated MMSET and R-loops as interaction partners with each other, and with the RNA helicases DHX9, DDX5, and DDX3. Three differentiation assays performed on heterozygous MMSET and MMSET null cells revealed no delayed pluripotency exit, but an altered ability to differentiate into the three germ layers upon MMSET removal. During immunofluorescence staining, we detected alterations in R-loop accumulation, and in foci formation of the DNA damage response proteins, H2AX and 53BP1, in MMSET deleted cells upon oxidative stress. Moreover, we validated R-loop enrichment in the PcG repressed gene Gata4, independent of MMSET. Despite the observed altered differentiation ability, the overall effects upon removal of MMSET in R-loop biology were small. Overall, future studies may provide additional knowledge of how MMSET affects R-loop accumulation and distribution along the genome.

Epigenetikk og epitranskriptomikk er vist å påvirke genregulering, og er koblet til mange ulike sykdommer og utvikling av kreft. Reversible endringer i genuttrykk som ikke påvirker nukleinsyresekvensen, er definert som epigenetisk regulering, mens modifikasjoner på RNA er kjent som epitranskriptomisk regulering. Målet med denne studien var å undersøke hvordan epigenetiske og epitranskriptomiske modifikasjoner påvirker genregulering i embryonale stamceller fra mus, ved å se på to ulike aspekter: hvordan «leserproteinene» YTHDF1-3 (DF1-3) påvirker cellulære prosesser, og rollen til et kromatinmodifiserende protein, MMSET, i biologien til R-loops.

YTHDF1-3-proteinene er cytoplasmiske lesere, som gjenkjenner og binder N6-metyladenosin (m6A) modifikasjoner. DF1-3-proteinene har blitt vist å både promotere translasjon og påvirke mRNA-stabiliteten. Enkelte studier rapporterer at DF1-3 har like funksjoner på grunn av høy sekvenslikhet, likevel påpeker de fleste andre studier ulike funksjoner. Derfor gjenstår det fortsatt å finne ut hvordan DF1-3-proteinene utfører deres potensielt ulike oppgaver, og om de binder de samme eller ulike m6A seter.

Vi ønsket å slå ut Df1-3 genene hver for seg og i ulike kombinasjoner i embryonale stamceller fra mus, og endelig undersøke hvordan DF1-3 proteinene påvirker proliferasjon og differensiering, samt samspillet mellom dem. Vi brukte creERT2 rekombinase og CRISPR/Cas9 teknologi for å slå ut Df1, Df3, Df1/2, og Df1/3 genene. Vi observerte ubetydelige forandringer med tanke på vekst i embryonale stamceller fra mus som manglet en eller to ulike Df1-3 gener. Deretter testet vi muligheten for differensiering i de genererte cellelinjene, og vi observerte da en forandring for differensiering, spesielt mot den neuroektoderme cellelinjen. De funnene som ble gjort samsvarer med teorien om at endringer i epigenetikk og epitranskriptomikk ikke påvirker celledeling, men heller differensiering av embryonale stamceller.

Den andre delene av denne oppgaven handler om rollen til et histonmodifiserende protein, Multiple-Myeloma SET domain, MMSET, som er viktig for R-loop-biologi. MMSET-proteinet metylerer histoner, og har vist seg å være viktig i overgangen fra pluripotent til differensiert tilstand, samt i dannelse av det mesendoderme kimlaget. I tillegg har MMSET blitt koblet til R-loop-biologi som en interaksjonspartner med R-loops. R-loop består av tre nukleinsyre tråder: ett dobbelttrådet DNA-RNA hybrid og et enkelttrådet DNA. R-loops har en fysiologisk rolle i cellulære prosesser, men spiller også ofte en patologisk rolle med negativ påvirkning på transkripsjon og replikasjon, i tillegg til å være forbundet med DNA skade. I tillegg er R-loops rapporter å være beriket i polycomb nedregulerte gener. Derfor ville vi validere MMSET som en interaksjonspartner med R-loops i embryonale stamceller fra mus, og videre se på effektene i R-loop biologien ved å slå ut MMSET genet.

Ved å utføre immunpresipitering kombinert med western blotting ønsket vi å validere MMSET og R-loops som interaksjonspartnere med RNA helikasene DHX9, DDX5, og DDX3, i tillegg til med hverandre. Differensieringsforsøk ble utført på MMSET+/- og MMSET-/- celler. Resultatene viste at det ikke var noen forsinket utgang fra en pluripotent tilstand ved å slå ut MMSET. På den andre siden, var evnen for differensiering til de tre ulike kimlagene endret. Ved å bruke immunfluorescence forsøk oppdaget vi endringer i akkumulering av R-loops, samt økt foci-dannelse av H2AX og 53BP1 ved å indusere oksidativt stress i MMSET-/- celler. Vi validerte at R-loops er beriket i det polycomb nedregulerte genet Gata4 uavhengig av MMSET. Med unntak av den reduserte evnen for å nå en differensiert tilstand, observerte vi generelt små endringer med tanke på R-loop-biologien ved å fjerne MMSET. Fremtidige studier vil forhåpentligvis gi en dypere forståelse av hvordan MMSET påvirker akkumulering og distribusjon av R-loop i genomet.