Searching for a redox partner for bacterial lytic polysaccharide monooxygenases

Abstract

Biomass is considered a vast resource for supplying sustainable and renewable energy. Lignocellulose is the most abundant source of biomass found on earth and utilization of this energy source is studied around the world. Enzymatic degradation is a promising approach to produce fuels, chemicals and materials from lignocellulosic biomass. A wide array of biomass-degrading enzymes can be found in nature, e.g. in white- and brown rot fungi, or in bacteria such as Cellvibrio japonicus. The discovery of lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) has been of tremendous importance in understanding and utilizing biomass degradation processes. LPMOs are oxidative mono-copper enzymes that degrade glycosidic bonds in recalcitrant polysaccharides such as cellulose and chitin. The LPMOs require an initial reduction of the copper active site and a dioxygen co-substrate (e.g. O2 or H2O2) before catalysis can occur. In vitro studies commonly use reducing agents such as ascorbic acid to facilitate this reduction. In fungi, several redox enzymes that can directly interact with and reduce the LPMO active site have been described. In addition, several of those redox partner enzymes can also produce and supply the LPMO with H2O2. However, for bacterial LPMOs no similar redox partners have been identified so far, although a few potential candidates have been suggested. This study examines the potential redox ability of two such candidates, hereinafter called LPMO activating protein A and B (LapA and LapB), from the marine bacterium Saccharophagus degradans. These proteins were tested for their potential ability to drive the LPMO from the same organism, called SdLPMO10A. In addition, this novel tri-modular LPMO was subjected to functional characterization where it was shown to be a C1-oxidizing, cellulose-active enzyme with optimal activity at 60 °C. The apparent melting temperature of the copper-loaded enzyme was measured to 57 °C and 47 °C when the copper was removed from the active site. The C-terminal carbohydrate-binding domain was shown to bind cellulose, but the internal domain is still of unknown function and calls for further characterization. LapA and LapB are also multi-modular enzymes which have similar sequence- and domain organization as two proteins that has been shown to be co-expressed with LPMOs and are important for optimal growth on cellulose in the bacterium Cellvibrio japonicus. Like SdLPMO10A, LapA bound to cellulose, but LapB did not show any binding which may be a result of incorrect folding during a denaturation/refolding process. Initial activity tests of LapA and LapB to drive SdLPMO10A did not result in desired oxidative LPMO activity during the tested conditions. There are many factors which have yet to be explored, the main being to investigate the occurrence of a potent redox cofactor present in LapA and LapB. For the time being, LapA and LapB remain potential candidates for bacterial redox partners of LPMOs.

Biomasse blir ansett som en viktig kilde til bærekraftig og fornybar energi. Lignocellulose er den største kilden til biomasse som finnes på planeten, og bruk av denne energikilden blir studert verden rundt. Enzymatisk nedbryting er en lovende tilnærming for å produsere drivstoff, kjemikalier og andre materialer fra lignocellulose. I naturen finnes mange enzymer som deltar i nedbryting av biomasse. Oppdagelsen av lytisk polysakkarid monooksygenaser (LPMOer) har vært svært viktig for forståelsen og nyttegjøringen av enzymatisk nedbryting på biomasse. LPMOer er enzymer som bryter glykosidbånd i polysakkarider som er utfordrende å bryte ned, slik som cellulose og kitin. For å aktivere LPMOer kreves en reduksjon av kobber i det aktive setet, samt dioksygen som ko-substrat (f.eks. O2 or H2O2). In-vitro studier bruker vanligvis reduktanter som askorbinsyre for å oppnå denne aktiverende reduksjonen. I sopp finnes det flere redoks-enzymer som kan interagere direkte med det aktive setet i LPMOer. I tillegg kan flere av disse redokspartner-enzymene også produsere H2O2 som LPMOer kan nyttiggjøre seg av. I bakterier finnes det fortsatt ingen kjente redokspartnere som kan redusere det aktive setet og produsere H2O2 for LPMOer, selv om det finnes flere enzymer som potensielt kan utføre disse oppgavene. Denne studien utforsker potensialet for to av disse enzymene fra den marine bakterien Saccharophagus degradans, videre kalt LapA og LapB, til å utføre reduksjonen av det aktive setet. Disse proteinene ble testet for deres evne til å fungere som redokspartnere ved å bruke LPMOen fra den samme type bakterie, kalt SdLPMO10A. Karakterisering av SdLPMO10A viste at det er et C1-oksiderende, cellulose-aktivt enzym med optimumstemperatur på 60 °C, Antatt smeltepunktet ble bestemt til 57 °C med kobber i det aktive setet, mens antatt smeltepunkt uten kobber i det aktive setet ble bestemt til 47 °C. Domenet i C-terminal ende av enzymet, antatt å være karbohydrat-bindene, viste binding til cellulose, mens det indre domenet er fortsatt ukjent, og bør karakteriseres videre. LapA og LapB er også multi-modulære enzymer som har liknende sekvens- og domenekarakteristika som proteiner som blir uttrykt sammen med LPMOene i Cellvibrio japonicus, og som er viktige for denne organismens vekst på cellulose. Som for SdLPMO10A viste også LapA binding til cellulose, mens LapB ikke viste binding, hvilket kan være et resultat av ukorrekt folding under forsøket på å denaturere og refolde proteinet. De første aktivitetstestene for LapA og LapBs redoks-aktivitet på SdLPMO10A viste ikke de ønskede resultatene for oksidasjons-aktivitet fra SdLPMO10A. Det er allikevel foreløpig mange faktorer å ta i betraktning som enda ikke er utforsket, hovedsakelig å undersøke om LapA og LapB inneholder en kraftig nok kofaktor til å redusere LPMOer. Det kan fortsatt konkluderes med at LapA og LapB enda ikke kan utelukkes som potensielle bakterielle redoks-partnere for LPMOer.