Effect of an enriched microbial environment on maintenance of gut health and tissue homeostasis in mice

Abstract

Introduction: The house mouse, as humans and other animals, have co-evolved with the billions of microbes surrounding them and colonizing their bodies and composing their microbiota. Microbes colonizing the gut, namely the gut microbiota, comprises the largest density of microbes, and the symbiotic relationship between the host and gut microbiota profoundly influence host health. Some anaerobic colonic bacteria have the ability to produce Short-chain fatty acids (SCFAs) through bacterial fermentation. Butyrate is a SCFA shown to pose the main energy source for colonic epithelia, and is important in regulation of gene expression of genes associated with cytokine production, maintenance of tissue homeostasis and immune response in the gut. This knowledge may complicate the interpretation of findings from traditional mice studies using mice housed in laboratory cages under strictly hygienic conditions, deprived of microbial encounters. Thus, to study mice in a more natural, evolutionary habitat poses a novel opportunity to recapitulate realistic responses. Aim: The overall aim of this project was to study the effects of a microbially rich environment on gut health in mice, by comparing mice housed in a simulated natural habitat or in conventional cages. This project was focused on unravelling possible differences in expression of genes involved in colonic homeostasis and inflammation, and faecal content of SCFAs, in mice housed in the two contrasting environments. Method: The expression of genes was assessed by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) conducted on complementary DNA (cDNA) synthesized from RNA. This RNA was extracted and isolated from the distal part of mice colons. Faecal content of short-chained fatty acids (SCFA) was measured by Gas chromatography (GC), with a flame ionization detector (FID). Various statistical analyses were applied, to determine the differences in the results from the two groups. Results: The GC-FID analysis showed that butyrate concentration were significantly higher in faeces from lab mice than pen mice. Results from the qPCR showed that TNFα and iNOS had significant higher expression in distal colon of pen mice, than lab mice. Expression results for the other five genes; NOD1, NOX1, NOX2 and MUC2 demonstrated a tendency to be upregulated in colonic mucosa from pen mice compared to lab mice, however not significantly so. Conclusion: Considering all the results together with the acquired knowledge about the collaborative relation between butyrate and the selected genes, demonstrates that being exposed to an enriched bacterial environment might strengthen and prime the immune system and the mucosal barrier function. Significantly higher expression of TNFα and iNOS in pen mice colon indicates a prepared immune system with high possibly higher number of primed pro-inflammatory cells such as macrophages. The results may also indicate that this situation improves maintenance of the mucosal barrier function and epithelial integrity. A lower faecal butyrate level in pen mice could be explained by a rapid turnover rate of colonic epithelia, and a corresponding oxidation of butyrate by colonocytes, leading to lower levels of butyrate in faeces and healthy colonocytes.

Introduksjon: Husmusen, på lik måte som mennesker og andre dyr, har utviklet seg i takt med milliarder av mikrober som omgir dem og som koloniseres i kroppene deres og komponerer mikrobiotaen deres. Mikrober som koloniserer tarmen, kalles tarmens mikrobiota, og dens egenskaper muliggjør et symbiotisk forhold mellom verten og tarmens mikrobiota, noe som påvirker vertens helse i stor grad. Noen anaerobe bakterier i tykktarmen har evnen til å produsere kortkjedede fettsyrer gjennom bakteriell gjæring (fermentering). Butyrat er en slik fettsyre, og er vist å være den viktigste energikilden for tykktarmsepitel, og er viktig i regulering av genuttrykk av gener assosiert med cytokinproduksjon, vedlikehold av vevshomeostase og immunrespons i tarmen. Denne kunnskapen kan komplisere tolkningen av funn fra tradisjonelle musestudier, hvor det blir benyttet mus som er fostret opp i laboratoriebur under strenge hygieniske forhold, uten å bli utsatt for mikrobielt liv. Å studere mus fostret opp i et mer naturlig bakterielt miljø gir en ny mulighet til å gjenskape realistiske resultater innen forskning på sykdomsutvikling og immunsystemet. Hensikt: Det overordnede målet med dette prosjektet var å studere effektene av et mikrobielt beriket miljø på tarmhelse hos mus, ved å sammenligne mus som er fostret opp i et simulert naturlig habitat (bingemus) eller i delvis sterile konvensjonelle lab-bur (labmus). I dette prosjektet ble det fokusert på å avdekke mulige forskjeller i genuttrykk for gener involvert i vevshomeostase og betennelse i tykktarmen, og fekalt innhold av kortkjedede fettsyrer, hos mus som er fostret opp i de to ulike miljøene. Metode: Genuttrykk ble studert ved bruk av kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPKR) utført på komplementært DNA (cDNA) syntetisert fra RNA. Dette RNAet ble ekstrahert og isolert fra den distale delen av tykktarm fra mus. Fekalt innhold av kortkjedede fettsyrer ble målt ved gasskromatografi (GK), med en flammeioniseringsdetektor (FID). Ulike statistiske analyser ble utført for å bestemme signifikante forskjeller i resultatene mellom de to gruppene. Resultater: GK-FID-analysen viste at butyratkonsentrasjonen var betydelig høyere i faeces fra labmus enn bingemus. Resultater fra qPKR viste at TNFa og iNOS var signifikant høyere uttrykt i distal tykktarm hos bingemus, enn labmus. Genuttrykk for de andre fem genene; NOD1, NOX1, NOX2 og MUC2 demonstrerte en tendens til å bli oppregulert i tykktarm hos bingemus sammenlignet med labmus, men ikke med signifikant forskjell. Konklusjon: Tatt i betraktning alle resultatene sammen med den ervervede kunnskapen om samarbeidet mellom butyrat og de studerte genene, viser det at å bli utsatt for et beriket bakteriemiljø kan styrke og forberede immunforsvaret og tarmepitelets beskyttende barriere. Signifikant høyere ekspresjon av TNFα og iNOS i tykktarm hos bingemus kan indikere et godt forberedt immunforsvar med et høyt antall makrofager, i tillegg til opprettholdelse av den beskyttende barrierefunksjonen og integriteten i tarmepitelet. Et lavere fekalt butyratnivå hos bingemus kan forklares ved rask fornyelse av tykktarmsepitel og en tilsvarende nedbryting av butyrat gjort av epitelcellene, fører til lavere nivåer av butyrat i faeces og sunne epitelceller i tykktarmen.