Using CRISPR interference to study novel biofilm-associated genes in Staphylococcus aureus

Abstract

The opportunistic pathogen S. aureus causes biofilm-associated infections which are often chronic and difficult to eradicate. As S. aureus is often resistant to multiple antibiotics, understanding the underlying processes of biofilm formation and regulation is crucial to identify novel treatment strategies. Although many genes have already been implicated to be involved in S. aureus biofilm formation, much is still unknown. Functional studies of genes by deletion or inactivation is time-consuming and restricted to non-essential genes. In this work, knockdown of gene expression by CRISPR interference (CRISPRi) was explored as a method to identify new biofilm-associated genes in S. aureus. Initially it was shown that CRISPRi can be used as a fast and simple method to study biofilm-associated genes in S. aureus in two different biofilm model systems, namely the crystal violet microtiter plate assay and the macrocolony formation assay. Thereafter, several new putative biofilm-associated genes were identified. By CRISPRi-based knockdown of gene expression for a selection of genes, we identified three WalRK regulated genes involved in biofilm formation in the crystal violet microtiter plate assay. While two of the genes, atl and sle1 have already been associated with biofilm formation, we also discovered an uncharacterized gene SAOUHSC_00671 whose role in biofilm formation is still unknown. SAOUHSC_00671 depleted cells showed a reduction in biofilm formation and increased clustering when analyzed by confocal microscopy. SAOUHSC_00671 harbors LysM domains and a CHAP domain, suggesting that this protein might be a cell wall hydrolase, whose role in S. aureus biofilm needs to be further investigated. A genome wide CRISPRi library was used to screen for novel biofilm genes using a macrocolony formation assay. With this approach, several genes of the central metabolic pathways were found to affect the wrinkling and structuring of S. aureus macrocolonies. These include PckA, involved in gluconeogenesis, and FumC and SucA, both involved in the TCA cycle. Furthermore, depletion of ubiE and hemE, encoding enzymes involved in the synthesis of menaquinone and heme, respectively, resulted in macrocolonies with a loss of structure and surface wrinkling. Based on these data, we propose a link between macrocolony formation and respiratory metabolism in S. aureus. Finally, in the same screen, a putative methyltransferase was also shown to be important for S. aureus macrocolony structuring, and the molecular function of this gene needs to be further investigated.

S. aureus er en opportunistisk bakterie som forårsaker biofilm-relaterte infeksjoner som ofte er kroniske og vanskelig å behandle. Siden S. aureus også ofte er resistent mot flere antibiotika, er det viktig å finne nye behandlingsmetoder. For å kunne gjøre dette er det nødvendig å forstå prosessene som ligger til grunn for biofilm dannelse- og regulering. Selv om mange gener allerede har blitt beskrevet i S. aureus biofilm, er det fortsatt mye som er ukjent. Det å studere gen-funksjonalitet i S. aureus er en tidkrevende prosess som også er begrenset til å studere ikke-essensielle gener. I dette arbeidet har vi undersøkt om nedregulering av genekspresjon ved CRISPR interferens (CRISPRi) kan brukes som en metode for å identifisere nye biofilm-relaterte gener i S. aureus. Det ble innledningsvis vist at CRISPRi kan brukes som en rask og enkel metode for å studere gener involvert i biofilm dannelse i S. aureus ved hjelp av to ulike modell systemer, krystallfiolett-mikrotiterassayet og et makrokoloniassay. Deretter ble det identifisert flere nye gener som potensielt er involvert i biofilm dannelse. Ved å slå ned genekspresjon ved bruk av CRISPRi for en rekke gener, identifiserte vi tre gener under regulering av WalRK som var involvert i biofilmdannelse i krystallfiolett-mikrotiterassayet. Selv om to av disse genene, atl og sle1, allerede har blitt assosiert med biofilmdannelse, identifiserte vi et gen, SAOUHSC_00671, hvis rolle i biofilmdannelse fortsatt er ukjent. Celler hvor SAOUHSC_00671 ekspresjon var slått ned viste en reduksjon av biofilm. Uvanlige klynger av celler ble observert ved bruk av konfokal mikroskopi. SAOUHSC_00671 har flere LysM domener i tillegg til et CHAP domene, noe som indikerer at dette proteinet potensielt er involvert i hydrolyse av cellevegg. Rollen til dette proteinet i biofilmdannelse krever videre undersøkelser. Ved bruk av et CRISPRi bibliotek ble det gjennomført et genomskala makrokoloniassayeksperiment for å lete etter nye gener involvert i biofilmdannelse. Genene pckA, som er involvert i glukoneogenesen, samt fumC og sucA som er involvert i TCA syklusen viste seg å påvirke struktureringen av makrokolonier. Videre viste det seg at mangelen på UbiE og HemE, enzymer som er involvert i henholdsvis syntese av menaquinone (vitamin K2) og heme, resulterte i makrokolonier med tap av struktur og rynker. Basert på disse resultatene foreslår vi en forbindelse mellom makrokolonidannelse og respirasjon i S. aureus. Avslutningsvis fant vi, i den samme screeningen, en potensiell metyltransferase som også viste seg å være viktig for strukturering av makrokolonier i S. aureus. De molekylære funksjonene til dette genet krever videre studier.