Karakterisering av antibiotikaresistens bakterier ( ESBL og Karbapenemaseproduserende) ved molekylærbiologiske og fysiologiske undersøkelser isolert fra vann

Abstract

Bakgrunn: Verdens helseorganisasjon (WHO) kaller antibiotika resistens en av de største truslene for vår framtidige helse. Hvis antibiotika klarer ikke å virke lenge på infeksjoner, kan vi mennesker i verste fall risikere en fremtid uten effektive antimikrobielle medisiner som gjør oss friske. Hensikten: Hovedmål med den oppgaven å detektere av betalaktamaser med utvidet spektrum (ESBL og karbapenemaser) i bakterier isolert fra akvatiske miljøer ved bruk av fenotypiske og genotypiske metode. Eventuelle positive resultater av antibiotika resistens bakterier skulle bidra til økt kunnskap om bakteries opprinnelse og hvordan den sprer seg i vannmiljøet. Metodene: Fem vannprøver var hentet fra Årungen i høstsemesteret 2018 og tre vannprøver fra NMBU Niagarabekken i vintersemester 2018. Alle prøvene var dyrket på selektive kromogiene medier for detektering av ESBL og CRE (BrillianceTM ESBL og BrillianceTM CRE Agar). Genotypiske metoder inkluderter amplifisering og separering av DNA med henholdsvis PCR (multipleks og singelpleks) og agarosegelelektroforese. Ifølge resultater var gjørt videre Sangersekvensering (16S rRNA og resistengener) og helgenomsekvensering (MinION/ARMA). Det var benyttet molekylære metoder for å bekrefte eller avkrefte fenotypiske positive resultater, samtidig var undersøkt hvilken gen og bakterier som var i prøvene. Resultatene: Det ble funnet bekreftet funn av antibiotikaresistensgener i vannprøvene fra Årungen og Niagara fra NMBU. Aktuelle AR prøver ble undersøkt med Sanger sekvensering, MinION, ARMA, MiSeq og Disk Diffusjonstest, og det ble bekreftet funn av resistente gener. Særlig interessant var at det ble funnet et nytt patogent gen som fintes ingen ikke ga 100% identiske proteiner i databasen, men resultatet under viste at det proteinet som lignet mest, og det proteinet som finnes i en Klasse-A beta-laktamase fra en Paraburkholderia stamme som heter DHOM06. Det ble bekreftet resistens i Pseudomonas fluorescens og S. maltophilia. Konklusjon: Det konkluderes med at ble funnet antibiotikaresiste bakterier i vannmiljøet, og det vekker stor bekymring at det ble funnet et nytt patogent gen som ikke finnes databasen, men som ligner mest på i en Klasse-A beta-laktamase fra en Paraburkholderia stamme som heter DHOM06. Det er grunlag for å forske videre på denne patogene bakterie, da vi ikke har noe kunnskap om den.

Background: The World Health Organization (WHO) calls antibiotic resistance one of the biggest threats to our future health. If antibiotics fail to last long on infections, we humans can at worst risk a future without effective antimicrobial drugs that makes us healthy. Purpose: The main objective was the task of detecting extended spectrum beta-lactamases (ESBL and carbapenemases) in bacteria isolated from aquatic environments using phenotypic and genotypic methods. Any positive results of antibiotic resistance bacteria should contribute to increased knowledge about the origin of bacteria and how it spreads in the aquatic environment. The methods: Five water samples were taken from Årungen in the fall semester 2018 and three water samples from the NMBU Niagara Basin in winter semester 2018. All the samples were grown on selective chromatography media for detection of ESBL and CRE (BrillianceTM ESBL and BrillianceTM CRE Agar). Genotypic methods include amplification and separation of DNA by PCR (multiplex and single plex, respectively) and agarose gel electrophoresis. According to results, further sequencing was done (16S rRNA and resistance genes) and whole-genome sequencing (MinION / ARMA). Molecular methods were used to confirm or reject phenotypic positive results, while at the same time the gene and bacteria in the samples were examined. Results: It was found and confirmed antibiotic resistance genes in the water samples from Årungen and Niagara from NMBU. Current AR samples were examined with Sanger sequencing, MinION, ARMA, MiSeq and Disk Diffusion tests which were confirmed for the detection of resistant genes. In particular, new pathogenic genes such as fine-tuning 100% identical proteins were found in the database, but the result below shows that the protein most closely resembled the protein found in a Class-A beta-lactamase from a Paraburkholderia strain called DHOM06. Resistance Pseudomonas fluorescence and S. maltophilia were confirmed. Conclusion: It is concluded that antibiotic resistance was found in the aquatic environment and it is of great concern that a new pathogen gene was found that is not in the database but most similar to a Class-A beta-lactamase from a Paraburkholderia strain called DHOM06. It is neccesery to further investigate the pathogenic bacterium because of our lack of knowledge.