Påvisning av hemolysiner og ß-laktamaser med utvidet spektrum (ESBL og karbapenemaser) blant bakterier isolert fra spiseklar salat i Norge

Abstract

Bakgrunn: Antibiotikaresistens er et økende problem og en trussel for den globale folkehelsen. Spredningen av multiresistente bakterier er en bekymring, spesielt humanpatogene bakterier som har ß-laktamaser med utvidet spektrum (ESBL). De er resistente mot ß-laktam, den viktigste gruppen antibiotika som benyttes i dag. Det finnes bakterier over alt i miljøet, samt blant dyr og mennesker, og mat kan lett kontamineres. Det blir viktig å få en oversikt over mangfoldet av bakterier i mat, om disse kan forårsake sykdom og om de er multiresistente.

Hensikt: Hensikten med denne masteroppgaven var å påvise hemolysiner og ß-laktamaser med utvidet spektrum (ESBL og karbapenemaser) blant bakterier isolert fra spiseklar salat i Norge.

Metode: Det ble samlet inn ulike varianter av spiseklar salat, med og uten tilbehør. Prøvene ble fortynnet og dyrket på blodagar, samt de selektive mediene BrillianceTM ESBL- og BrillianceTM CRE agar. Bakteriekolonier ble isolert og ekstrahert for 16S- og multiplex PCR, der de ble screenet for ESBL-gener. Gelelektroforese ble benyttet for å se eventuelle funn av gener, og prøvene ble sekvensert ved bruk av Sanger-sekvensering. Fire prøver ble sendt til helgenomsekvensering med Illumina MiSeq. Totalt seks prøver ble sensitivitetstestet med MIC for ulike typer antibiotika.

Resultater: Det ble observert vekst på blodagar fra alle prøvene, der de fleste koloniene vokste med beta-hemolyse. Flere av prøvene viste fenotypisk resistens mot antibiotika med vekst av kolonier på selektiv agar. Koloniene viste ingen utslag ved gelelektroforese etter multiplex PCR. Helgenomsekvensering viste hvilke bakterier som var i prøvene og viste funn av resistens- og virulensgener. Sensitivitetstesting viste at bakteriene var resistente mot flere typer antibiotika, og at enkelte bakteriestammer var multiresistente.

Konklusjon: Det ble gjort funn av flere ulike bakterier fra spiseklar salat og tilbehør. Flere av bakteriene vokste med beta-hemolyse på blodagar og kunne være patogene. Kolonier vokste på selektiv agar med antibiotika, noe som indikerte at bakterien var resistent. Helgenomsekvensering viste at flere av bakteriestammene hadde gener som kodet for resistens mot både antibiotika, desinfeksjonsmidler og ulike metaller. Bakteriene hadde også ulike virulensfaktorer som er sett i sammenheng med sykdom hos mennesker.

Background: Antibiotic resistance is a growing problem and a threat to global health. The spread of multidrug-resistant bacteria is a concern, especially human pathogenic bacteria that have extended spectrum ß-lactamases (ESBL). They develop resistance to ß-lactam, the most important group of antibiotics. There are bacteria everywhere in the environment, as well as among animals and humans. As a consequence, food can easily be contaminated. It is important to get an overview of the diversity of bacteria in food and whether they are multidrug resistant.

Purpose: The purpose of this master thesis was to detect hemolysins and extended spectrum ß-lactamases (ESBL and carbapenemases) among bacteria isolated from RTE-salad in Norway.

Method: Various samples of RTE-salad were collected. The samples were diluted and grown on blood agar, as well as the selective agar BrillianceTM ESBL- and BrillianceTM CRE. Bacterial colonies were isolated and extracted for 16S- and multiplex-PCR, where they were screened for ESBL genes. Gel electrophoresis was used to detect resistance genes, and the samples were sequenced by Sanger sequencing. Four samples were submitted for whole-genome sequencing with Illumina MiSeq. A total of six samples were sensitivity tested with MIC for different types of antibiotics.

Results: Blood agar growth was observed from all samples, with most colonies having beta-hemolysis. Several of the samples showed phenotypic resistance to antibiotics with the growth of colonies on selective agar. The colonies showed no results by gel electrophoresis after multiplex PCR. Whole-genome sequencing showed which bacteria were in the samples and findings of resistance and virulence genes. Sensitivity testing revealed that the bacteria were resistant to several types of antibiotics and that some bacterial strains were multidrug resistant.

Conclusion: Different strains of bacteria from RTE-salad were identified. Several of the bacteria grew with beta-hemolysis on blood agar, which could indicate that they were pathogenic. Colonies grew on selective agar containing antibiotics, indicating that the bacteria were resistant. Whole genome sequencing showed that several of the bacterial strains had genes that encodes resistance to antibiotics, disinfection and metals. The bacteria also had various virulence factors that can cause human disease.