Kan degradering i mRNA predikere alder på biologiske spor?

Abstract

DNA-analyser er et viktig verktøy for å knytte et individ til et biologisk spor funnet på et åsted. DNA gir i hovedsak kun informasjon om identitet, og sier ikke noe om når eller hvordan et spor ble avsatt. RNA har tidligere blitt ansett som for følsomt for bruk i rettsgenetiske analyser. Senere studier har dokumentert at RNA er mer stabilt enn først antatt. Foreløpig er RNA forbundet med identifisering av celletype, men forskning på tidsbestemmelse foregår på området. Målet er at RNA kan supplere DNA-analyser ved å gi informasjon om celletype og til hvilken tid det biologiske materialet ble avsatt. Per dags dato er det ikke funnet en pålitelig metode for å predikere alder på et biologisk spor, men det er gjort flere lovende analyser på området. Målet med studien har vært å undersøke om det er sammenheng mellom tid og degraderingsrate i spesifikke mRNA-markører for spytt og blod. Det var også ønsket å undersøke om degraderingsraten mellom ulike mRNA varierte, samt om 5’- enden degraderte raskere enn 3’- enden.

I denne studien ble det samlet inn spytt- og blodprøver fra 16 frivillige deltakere. Det var til sammen 80 prøver som bestod av 35 spyttprøver og 45 blodprøver. Prøvene ble deretter plassert til lagring over en tidsperiode på 0 til 143 dager. RNA-ekstraksjon med fenol-kloroform ble utført med korte - og lengre tidsintervall for å observere endringer over tid. RNA-konsentrasjonen ble målt i hver prøve med Qubit™ Fluorometer. Videre ble 48 prøver inkludert for videre analyse. Det ble valgt ut 28 spesifikke mRNA-markører for spytt og blod. Deretter ble det forberedt et cDNA-bibliotek ved bruk av TruSeq® Targeted Expression kit. Avslutningsvis ble prøvene sekvensert på Illumina MiSeq® ved bruk av målrettet RNA-sekvensering. Sekvenseringsdataene ble benyttet for å undersøke antall «reads» for hver mRNA-markør og hvordan antallet forandret seg etter antall dager. Programvare for primær - og sekundær analyse av sekvenseringsdataene var forhåndsinstallert på maskinen, og ble benyttet for kvalitetskontroll og sammenstilling av sekvenser. Videre ble programvarene R og RStudio anvendt for datavisualisering og statistiske beregninger. Statistiske metoder som regresjonsanalyse og variansanalyse (ANOVA) ble benyttet i studien.

Resultatene for spyttprøvene viste en signifikant degradering over tid, som prinsipielt betyr at markørene i studien kan benyttes for å predikere tid. Markørene viste lignende degraderingsmønster, samt hastighet over tid. Dermed kunne det ikke utføres en normalisering, som er nødvendig for å kunne benyttes i rutinemessig arbeid. Det ble ikke funnet en forskjell i degraderingsrate mellom 3’- og 5’ - enden som kunne benyttes for å predikere tid. For blodprøvene var genet hemoglobin-beta (HBB) den eneste markøren som viste degradering over tid. Resterende blodmarkører i studien var for stabile. Det ble observert forskjell i degradering mellom to gen, hemoglobin-beta (HBB) og hemoglobin-delta (HBD), hvor ratioen korrelerte med tid. Dermed kan denne ratioen anvendes for å predikere tid. Det ble ikke observert ulik degraderingsrate mellom 3’- og 5’- enden for blodmarkørene.

Konklusjonen i denne studien ble at ratioen mellom to gener (HBB og HBD) som degraderer jevnt, men ulikt, kan benyttes for prediksjon av tid. Det var en signifikant degradering over tid for spyttmarkørene, men ettersom normalisering ikke ble foretatt, kan ikke modellen benyttes for andre datasett. Markørene bør evalueres i videre studier med andre primere, kortere tidsintervall og flere paralleller for hver deltaker. Det var ingen forskjell i degraderingsrate mellom 3’- og 5’- enden for markørene.

DNA-analysis is a valuable tool to link an individual to a biological stain detected at a crime scene. DNA provide information about identity and say nothing about when or how a stain was deposited. Previously, it has been assumed that RNA is too unstable to be used in forensic genetic analysis. More recently, it has been shown that RNA is more stable than initially thought. Currently, RNA is associated with body fluid identification, but research on estimation time since deposition is ongoing. The goal is to use RNA as a supplement for DNA analysis by providing information about cellular origin and at what time the biological material was deposited. To date, no reliable method has been found for predicting age on a biological stain, but several promising methods has been reported in this area. The aim of the study has been to demonstrate whether there is a relationship between time and degradation rate in specific salivary and blood mRNA-markers. The study will also examine whether the degradation rate between different mRNAs varied, as well as whether the 5’ - end of a transcript degrade faster than the 3’ - end.